[23]。圖SEQ圖\*ARABIC4無花果多糖對HepG-2細胞(a)、7901細胞(b)、SW1116細胞(c)的抑制率2實驗原理多糖是人生命活動的的重要物質，多糖在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血以及免疫促進等方面展現出生物活性作用REF_Ref158156831\r\h[9]。本實驗選取海南本地熱帶水果榴蓮蜜，以榴蓮蜜果實為原料，采用超聲提取法提取榴蓮蜜粗多糖，使用三氯乙酸除蛋白法除去樣品多糖中的蛋白質，再采用DEAE-52纖維柱和SephadexG-200葡聚糖凝膠柱分離純化，從而得到均一的榴蓮蜜多糖分子，以MTT方法檢測其對人肝癌細胞（SMMC-7721）的毒性并使用DPPH法和ABTS法以及羥基自由基清除法檢測抗氧化活性。3實驗部分3.1儀器、材料與試劑3.1.1實驗相關儀器表SEQ表\*ARABIC1實驗相關儀器儀器型號廠家實驗室超純水機YK-RO-B舒活泉（廈門）人工智能有限公司破壁料理機FN-800濟南方奈優品企業管理有限公司冷凍干燥機LC-10N上海力辰儀器科技有限公司電子天平PX1242H奧豪斯儀器（常州）有限公司超聲清洗機CJ100ST深圳市超潔科技實業有限公司臺式高速離心機H1850湖南湘儀實驗室儀器開發公司旋轉蒸發儀R-1001VN鄭州長城科工貿有限公司紫外-可見分光光度計UV-2700日本島津公司酶標儀SPL-318C昆明諾金科技有限公司倒置顯微鏡XDS-900C上海蔡康光學儀器有限公司61733.1.2細胞與材料本實驗采用海南本地榴蓮蜜，實驗選用細胞為人體肝癌細胞（SMMC-7721）。260393.1.3實驗相關試劑表SEQ表\*ARABIC2實驗相關試劑試劑廠家乙醇上海阿拉丁生化科技股份有限公司石油醚上海邁瑞爾化學技術有限公司三氯乙酸上海邁瑞爾化學技術有限公司DEAE-52纖維素BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.氫氧化鈉廣東光華科技股份有限公司濃鹽酸南京化學試劑股份有限公司氯化鈉上海邁瑞爾化學技術有限公司SephadexG-200葡聚糖凝膠粉末BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.濃硫酸南京化學試劑股份有限公司胎牛血液（FBS）上海睿鉑賽生物科技磷酸鹽緩沖液（PBS）上海麥克林生化科技股份DMEM培養基賽默飛世爾科技(中國)有限公司胰蛋白酶賽默飛世爾科技(中國)有限公司試劑廠家MTT試劑上海阿拉丁生化科技股份有限公司二甲基亞砜（DMSO）上海邁瑞爾化學技術有限公司DPPH試劑蘇州科銘生物技術有限公司ABTS試劑蘇州科銘生物技術有限公司硫酸亞鐵西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司水楊酸上海邁瑞爾化學技術有限公司3.2實驗方法3.2.1樣品預處理購買新鮮的榴蓮蜜，分離果肉和種子，使用超純水對果肉進行清洗后切片，裝入不銹鋼盒子中，放入冰箱內于零下30℃冷凍4h凍硬，再放入冷凍干燥機12h充分干燥，之后將其放入粉碎機并加入乙醇打碎浸泡8h以上除去色素，使用石油醚于70-80℃回流脫脂6-12h，取出脫脂后的樣品冷凍干燥12h，稱量，按1:20mg/mL的料液比加入超純水間歇超聲2h，將得到的樣品離心（6000r/min，10min）取上清液，45℃下旋蒸濃縮，之后迅速加入4倍體積的乙醇，在4℃下保持12h，然后離心取下層沉淀物，再將其冷凍干燥得未除蛋白的榴蓮蜜多糖。3.2.2榴蓮蜜多糖除蛋白本實驗采用三氯乙酸法去除樣品中蛋白質，首先將樣品溶解于錐形瓶中并冰浴，以保證溫度穩定。之后向錐形瓶中緩慢加入滴加15%的三氯乙酸溶液，使樣品PH達到2-3，然后在4℃下保持1h；再將溶液以每分鐘10000轉的轉速離心15min，取上層清液旋蒸濃縮，水浴溫度45℃，再進行透析、冷凍干燥的步驟，得到已除蛋白的榴蓮蜜粗多糖。3.2.3DEAE-52纖維柱層析將DEAE-52纖維素置于超純水中浸泡24h，期間用玻璃棒緩慢攪動；將上清液傾倒，再以NaOH溶液-HCl溶液-NaOH溶液的順序浸泡30min，每次酸堿浸泡均需用超純水洗至中性，NaOH溶液和HCl溶液的溶液均為0.5mol/L。用適量的超純水溶解攪拌，緩慢倒入層析柱（26×56mm），避免出現氣泡；超純水平衡過夜使柱料穩定。接下來，稱取200mg榴蓮蜜多糖樣品，用超純水溶解后，沿柱壁緩慢加入。由于榴蓮蜜多糖帶有負電荷，因此會與帶有正電荷的DEAE-52纖維素發生靜電相互作用，從而被吸附在纖維素上。為了將多糖從纖維素上洗脫下來，我們使用一系列梯度濃度的NaCl溶液（0.1-0.5mol/L）進行洗脫。NaCl溶液中的氯離子也會與纖維素的靜電相互作用，從而降低多糖與纖維素之間的結合力。通過逐漸增加NaCl溶液的濃度，我們可以逐步將多糖從纖維素上洗脫下來。在洗脫過程中，在這個過程中，5min收集一管，每管5mL。用硫酸-苯酚法檢測多糖含量，繪制洗脫曲線，我們可以觀察到不同濃度NaCl溶液下多糖的洗脫情況。根據曲線峰形，我們可以收集含有較高多糖含量的洗脫液。最后，將收集到的洗脫液進行旋蒸濃縮，水浴溫度45℃，再進行透析、冷凍干燥的步驟，得到初步分離的多糖組分。3.2.4葡聚糖凝膠柱層析將干燥的SephadexG-200葡聚糖凝膠粉末用超純水浸泡24h至充分溶脹，期間用玻璃棒緩慢攪動。采用濕法裝柱，葡聚糖凝膠溶解并充分攪拌后，緩慢倒入層析柱（26×56mm），避免氣泡和流干，裝好后用超純水平衡過夜。將初步分離的榴蓮蜜多糖溶解于超純水，加入200mg樣品（使用紫外測試計算），沿柱壁環繞緩慢加入。穩定后用超純水洗脫5min收集一管，每管5mL，共收集80管。用硫酸-苯酚法檢測多糖含量，繪制洗脫曲線，我們可以觀察到超純水下多糖的洗脫情況。根據曲線峰形，我們可以收集含有較高多糖含量的洗脫液。最后，將收集到的洗脫液進行旋蒸濃縮，水浴溫度45℃，再進行透析、冷凍干燥的步驟，得到分離的多糖組分。3.2.5紫外鑒別取5mg的榴蓮蜜多糖溶解在5mL的超純水中，利用UV-2700紫外-可見分光光度計以超純水為空白對照，在200-800nm波長范圍內進行紫外光譜掃描。210344體外活性研究261234.1體外抗氧化活性研究4.1.1DPPH自由基清除能力的測定將樣品溶解制成溶液（0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mg/mL），每種濃度制得3mL，取1mL待測溶液加入相同體積的DPPH乙醇溶液作為樣品組。再取1mL待測溶液加入相同體積的乙醇作為對照組，防止待測溶液自身的顏色干擾實驗結果。取1mL超純水，再向其中加入相同體積DPPH乙醇溶液作為空白對照。DPPH乙醇溶液濃度為1mmol/L。避光反應30min，再利用紫外光譜儀在517nm下檢測各對照組溶液相比于體積比1:1的乙醇水溶液的吸光度值，最后計算制得的榴蓮蜜多糖的DPPH自由基清除率。清除率計算公式：DPPH式中，A1為樣品組的吸光度值，A2為以無水乙醇為對照組的吸光度值，4.1.2ABTS自由基清除能力的測定將制得的榴蓮蜜多糖分別制成1mL0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的待測溶液，利用ABTS自由基清除能力檢測試劑盒，使用1mL石英比色皿檢測制得的榴蓮蜜多糖ABTS自由基清除能力。4.1.3OH自由基清除能力的測定將樣品溶解制成溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2mg/mL），每種濃度制得3mL，首先取1mL待測溶液，并向其中加入等體積的DPPH乙醇溶液，以此作為樣品組。接著，我們再取1mL待測溶液，并加入等體積的乙醇溶液，以此作為對照組。這樣做的目的是為了排除待測溶液自身顏色對實驗結果可能產生的干擾，確保實驗結果的準確性。取1mL超純水，再向其中加入相同體積硫酸亞鐵溶液、H2O2溶液和水楊酸乙醇溶液作為空白對照。硫酸亞鐵溶液、H2O2溶液和水楊酸乙醇溶液濃度均為2mmol/L。避光反應30min，再利用紫外光譜儀在510nm下檢測各對照組溶液相比于超純水的吸光度值，最后計算制得的榴蓮蜜多糖的羥基自由基清除能力。清除率的計算公式：羥基式中，A1為樣品組的吸光度值，A2為對照組的吸光度值，4.2體外抗腫瘤活性研究4.2.1細胞的培養在進入細胞培養室之前，務必將雙手徹底清潔，并更換為室內專用的拖鞋，以保證環境的清潔度。在實驗開始前，需將培養基預熱至室溫，隨后利用倒置顯微鏡仔細觀察細胞的形態，根據觀察結果，決定是否需要更換培養液或是進行細胞傳代。超凈臺則需經過30min的紫外照射，并用75%的酒精進行全面消毒，以營造一個無菌的工作環境。接著，需準備所需的試劑，并按規范進行擺放。從無菌短管中取出一根，加熱以消除水霧，并安裝無菌吸管頭，以備后續使用。隨后，取出培養瓶，將瓶口靠近酒精燈進行消毒處理。倒出舊的培養基后，使用PBS進行清洗，確保無氣泡殘留。如需替換培養液，只需加入適量DMEM即可；若需進行細胞傳代，則需添加胰蛋白酶，并封閉培養瓶，旋轉以確保胰蛋白酶均勻覆蓋細胞層。觀察細胞的消化狀態，當細胞消化至大約80%呈現亮圓點時，停止消化。使用短管輕柔地吹打細胞表面，以收集細胞懸液。將細胞懸液分裝至不同的培養瓶中，并補充適量的培養基。最后，將培養瓶放入培養箱中，繼續進行細胞培養。321264.2.2細胞計數法 在進行細胞計數的準備階段，我們首先需要確保細胞計數板和蓋片的清潔度，這可以通過使用乙醇來完成清潔過程。隨后，我們輕柔地打散細胞，力求將其分散成單個狀態。接下來，從懸浮液中精確地取出10μL的樣本，并加入到上樣口中。讓樣本靜置3min，使細胞通過毛細作用自然進入細胞計數池，并均勻占據整個網格空間。在計數過程中，我們的主要任務是統計計數板上四個方格內所有細胞的數量。需要注意的是，對于壓線細胞，我們只計算其上方和左側的細胞，以避免重復計數。完成計數后，我們將所得數據代入相應的公式中進行計算，從而得到準確的細胞數量。計數公式：細胞數式中，除以4是計算了4個大格細胞總數；乘以是因為計數板中每個大格的體積是：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3=10-4mL。4.2.3榴蓮蜜多糖的抗腫瘤活性為了進行體外培養，我們選用了含有1%雙抗的高糖DMEM培養基，并補充了10%的滅活胎牛血清。隨后，在恒溫37℃、含有5%CO2的適宜環境下，我們將SMMC-7721細胞置于培養箱中進行培養。為了確保實驗的準確性，我們選用了正處于指數生長期的細胞，將其制備成均勻的細胞懸液，將這一細胞懸液接種于孔板中，并繼續培養12h，以便進行后續的實驗操作。實驗組加入200μL含有梯度濃度50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL的榴蓮蜜多糖樣品培養基，并設置對照組（相同細胞，相同濃度梯度的榴蓮蜜多糖溶解介質、培養液），培養48h，獨立重復3次。之后取20μL的5g/LMTT加入到每個孔當中，再把細胞放在培養箱中孵育4個小時，吸除孔板中的上清液，并向每個孔中準確加入150μL的二甲基亞砜（DMSO）。隨后使用酶聯免疫檢測儀在490nm波長下測量各孔的吸光度值。基于測量得到的數據，我們依據預設的公式計算了榴蓮蜜多糖對SMMC-7721細胞的增殖抑制率。細胞增殖抑制率公式：式中，A1為對照組吸光度值；A5結果5.1紫外鑒別如REF_Ref20749\h圖5所示，UV-2700紫外-可見分光光度計在200-800nm波長范圍內進行紫外光譜掃描發現多糖在230nm到280nm的波段并沒有明顯的吸收，所以提取的產物中的蛋白質和核酸已經被分離，產物純度很有保障。圖SEQ圖\*ARABIC5多糖在200-800nm的紫外吸收光譜5.2榴蓮蜜多糖的抗氧化能力5.2.1DPPH自由基清除能力由REF_Ref22169\h圖6可知，榴蓮蜜多糖具備清除DPPH自由基的能力，其IC50值測得為1.507mg/mL。具體而言，當榴蓮蜜多糖的濃度達到1.60mg/mL時，其對DPPH自由基的清除效率可達57.29%。這一結果表明，榴蓮蜜多糖在抗氧化領域具有一定的潛在應用價值。圖SEQ圖\*ARABIC6榴蓮蜜多糖的DPPH自由基清除能力5.2.2ABTS自由基清除能力由REF_Ref21944\h圖7所示，榴蓮蜜多糖具備清除ABTS自由基的能力，其IC50值測得為1.216mg/mL。具體而言，當榴蓮蜜多糖的濃度達到1.00mg/mL時，其對DPPH自由基的清除效率可達42.38%。這一結果表明，榴蓮蜜多糖在抗氧化領域具有一定的潛在應用價值。圖SEQ圖\*ARABIC7榴蓮蜜多糖的ABTS自由基清除能力5.2.3羥基自由基清除能力由圖7所示，榴蓮蜜多糖具備清除羥基自由基的能力，其IC50值測得為6.018mg/mL。具體而言，當榴蓮蜜多糖的濃度達到1.20mg/mL時，其對DPPH自由基的清除效率可達32.70%。這一結果表明，榴蓮蜜多糖在抗氧化領域具有一定的潛在應用價值圖SEQ圖\*ARABIC8榴蓮蜜多糖的羥基自由基清除能力5.3榴蓮蜜多糖的抗腫瘤能力結果如REF_Ref23116\h圖9顯示，榴蓮蜜多糖無法有效抑制SMMC-7721，而且即使增大榴蓮蜜多糖濃度其對SMMC-7721抑制率變化依舊不太明顯。圖SEQ圖\*ARABIC9榴蓮蜜多糖的抗腫瘤能力6討論本實驗成功提取分離了榴蓮蜜多糖并將其配制成不同濃度的劑量組，我們分別測定了其對DPPH、ABTS以及羥基自由基的清除率。經過實驗測定，結果表明榴蓮蜜多糖確實展現出了抗氧化活性。進一步觀察發現，隨著樣品質量濃度的遞增，其抗氧化能力也呈現出逐步增強的趨勢。而通過MTT檢測發現榴蓮蜜多糖并不存在明顯的腫瘤抑制作用。為以后榴蓮蜜多糖的開發利用提供了理論依據。參考文獻任新軍.尖蜜拉引種試種[J].云南熱作科技,1999,(02):25.吳剛,楊逢春,閆林等.尖蜜拉在海南興隆的引種栽培初報[J].中國南方果樹,2010,39(05):60-61.胡福初,吳鳳芝,陳哲等.海南榴蓮蜜優質豐產栽培管理技術[J].果樹實用技術與信息,2020,(10):29-31.林玉鳳.海洋生物多糖/無機氧化物復合膜的制備與性能研究[D].青島大學,2023.胡佳,靳賀喜,蔣洢慧等.食品級微凝膠的類型、制備及應用進展研究[J/OL].中國油脂,1-19[2024-02-06].魏婷.黑參多糖提取純化、結構表征及生物活性研究[D].天津科技大學,2022.李紹平,吳定濤,趙靜.糖譜及其在中藥多糖質量控制中的應用[J].中國中藥雜志,2015,40(17):3505-3513.馬帥帥,章瑩,徐玲霞等.食藥兩用抗腫瘤中藥的有效成分及作用機制研究進展[J].中華中醫藥學刊,2024,42(01):184-188.王蓉,吳劍波.多糖生物活性的研究進展[J].國外醫藥(抗生素分冊),2001,(03):97-100.NiyigabaT,LiuD,HabimanaJDD.TheExtraction,FunctionalitiesandApplicationsofPlantPolysaccharidesinFermentedFoods:AReview[J].Foods(Basel,Switzerland),2