第十二章

植物遺傳標記與分子標記圖譜構建1本章重難點遺傳標記的發展DNA標記多態性的分子基礎各類分子標記的原理及分析流程

遺傳圖譜的構建分子標記與遺傳連鎖圖譜的應用2第一節

遺傳標記(Geneticmarker)是指可以穩定遺傳的、易于識別的特殊的遺傳多態性形式在經典遺傳學中，指等位基因的變（差）異在現代遺傳學中，指基因組中任何座位上的相對差異或者是DNA序列的差異3一、遺傳標記的作用在遺傳學研究中，遺傳標記作為染色體上的界標，主要應用于連鎖分析、染色體變異、基因定位、遺傳作圖及基因轉移等在作物育種中，通常把與育種目標性狀緊密連鎖的遺傳標記用于對目標性狀進行追蹤選擇、輔助選擇以及基因型鑒定4二、理想的遺傳標記應具備的條件多態性高表現共顯性(只有共顯性才能鑒定純合和雜合基因型)對主要農藝性狀影響小顯現標記需要的經費少便于識別和記載5形態標記(morphologicalmarkers)細胞學標記(cytologicalmarkers)生化標記(biochemicalmarkers)分子標記(molecularmarkers)三、遺傳標記的發展6指那些能夠用肉眼明確觀測的一類外觀特征性狀從廣義上講，形態標記還包括色素、生理特性、生殖（育性）特性、抗病蟲性等有關的性狀（一）形態標記

MorphologicalMarkers

7優點：形態標記簡單直觀，經濟方便，容易觀察記載缺點：數量少，難以建立飽和的遺傳圖受環境影響大有些標記與發育不良性狀連鎖8（二）細胞學標記

CytologicalMarkers

能明確顯示遺傳多態性的細胞學特征染色體數目的變化和染色體結構的變異9C-bandingpatternoftheamphiploid

T.aestivum

cvCS-Ae.speltoides

accession#82910缺點：鑒定困難，材料保存代價高標記數目有限難以開展精細定位11主要包括貯藏蛋白、同工酶等標記（三）生化標記

BiochemicalMarkers

12SDSseparatesproteinsbyMW13蛋白質電泳14優點： 基因表達的產物，可以直接反映基因產物的差異，受環境影響較小缺點：標記數量有限，不能滿足遺傳和育種的需要每一種同工酶標記都需特殊的顯色方法和技術某些酶的活性具有發育和組織特異性15（四）分子標記

MolecularMarker概念：指在分子水平上可標識的遺傳多態性轉換、顛換插入/缺失重排161、理想的分子標記應具有的特點高水平的多態性共顯性遺傳（可區分某一位點的純合或雜合狀態）在基因組中出現的頻率高在基因組中均勻分布具有中性選擇特征容易獲得而且可快速分析重復性好分離標記所需的費用低17182、分子標記分析的關鍵技術基因組DNA酶切PCR電泳Southernblot序列測定單個堿基的差異顯帶結果判讀19聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間202122顯帶瓊脂糖凝膠－－－EB染色聚丙烯酰胺凝膠－－－硝酸銀染色帶熒光分子的引物－－－熒光捕獲2324253、分子標記多態性的原理（1）酶切位點或引物結合位點的變化26（2）酶切位點或引物結合位點之間的插入突變個體1個體21227（3）酶切位點或引物結合位點之間的缺失突變個體1個體21228（4）酶切位點或引物結合位點之間的重復序列的重復次數的變化個體1個體21229（5）單個核苷酸的突變ATGTCGTATCATCGATGTAGTATCATCG304、分子標記的分類基于DNA-DNA雜交RFLP基于PCR

ISSR,SSR,RAPD,SRAP…基于PCR和RE酶切AFLP基于DNA測序SNP，EST，Retro-transposon應用最普遍的是RFLP、RAPD、AFLP和SSR標記31第二節分子標記技術一、基于分子雜交技術的分子標記

MolecularHybridization(核酸分子雜交)： 不同來源的單鏈DNA與單鏈DNA間，在長于20bp的同源區域內，以氫鍵連接方式互補配對，形成穩定的雙鏈結構的過程32基于DNA-DNA雜交（southernblotting)的標記RFLP:

RestrictionFragmentLengthPolymorphism(限制性片段長度多態性標記）VNTR:

VariableNumberTandemRepeats(minisatellites)

（可變數目串聯重復序列標記）33限制性片段長度多態性(RFLP)34RFLP是利用特定的限制性內切酶識別并切割（消化）不同生物個體的基因組DNA，由于不同個體等位基因之間堿基的互換、重排、缺失等變化導致限制性內切酶識別位點發生改變，從而造成基因型間限制性片段長度的差異35363738RFLP:single-locusprobe（單位點探針）核DNA基因組文庫cDNA文庫細胞質DNA葉綠體和線粒體DNA文庫特點位點特異性，共顯性大多數是物種特異性的39DNA探針標記可用放射性同位素3H，32P，33P非放射性物質生物素熒光染料40RFLP基本特點：共顯性缺點：探針必須是單拷貝或寡拷貝的檢測所需樣本DNA量大(5~15ug)實驗操作較繁瑣，成本較高，探針制備較麻煩，檢測中如要利用放射性同位素，易造成環境污染，檢測周期長可以用非放射性物質雜交信號相對較弱，靈敏度較同位素標記低且相對價格較高41二、基于PCR技術的分子標記短核苷酸序列引物耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）擴增目標DNA序列快捷、簡易、靈敏等優點42RAPD:RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA

（隨機擴增多態性）SSR:SimpleSequenceRepeats(Microsatellites)

（簡單序列重復）ISSR:Inter-simplesequencerepeat

（簡單序列重復間區）SCAR:SequenceCharacterizedAmplifiedRegion

（序列特征化擴增）STS:SequenceTaggedSites

（序列標簽位點）431、RAPDpronounced“rapid”1990年由Williams和Welsh提出的隨機引物（arbitraryprimer，8~10

bp），通過PCR擴增染色體組中的DNA，所獲得長度不同的DNA片段凝膠電泳分離擴增片段，經染色來顯示擴增片段的多態性4445S451對DH962×冀棉5號F2群體的擴增圖56:14≈52.5:17.546優點：技術簡單，檢測速度快RAPD分析所需DNA樣品量少(一般5~10ng)，對DNA質量要求較RFLP低不依賴于種屬特異性和基因組結構，一套引物可用于不同生物基因組分析成本較低缺點：顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子共遷移影響因素很多，穩定性和重復性差轉化為SCAR及STS等表現為共顯性標記472、序列特異擴增區域SCAR

(SequenceCharacterizedAmplificationRegion)將目標RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進行克隆并對其末端測序根據RAPD片段兩端序列設計特定引物，通常為18~24bp，一般引物前10個堿基應包括原來的RAPD擴增所用的引物對基因組DNA片段進行PCR特異擴增具有更高的重復性和穩定性；共顯性遺傳48lanes2–14–低2-丙烯基,低3-丁烯基bulklanes15–24–高2-丙烯基,高3-丁烯基bulk49503、SSR(簡單序列重復)又稱微衛星DNA，它是一類由1-6個堿基組成的基序(motif)串聯重復而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置如(CA)n、(AT)n、(GC)n、(GATA)n等重復，n＝10~605152（1）SSR產生的分子生物學原理復制滑移53CACACACACACACACACACA不等交換（Unequalcross）CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA對等交換不等交換CACACACACACACACACACA54某一特定的微衛星的側翼序列通常都是保守性較強的單一序列，因而可以將微衛星側翼的DNA片段克隆、測序，然后根據微衛星的側翼兩端互補序列人工設計合成引物，通過PCR反應擴增微衛星片段由于核心序列串聯重復數目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，個體的擴增產物在長度上的變化就產生長度的多態性（2）SSR分析技術原理555657（3）SSR的分析步驟獲得SSR引物PCR擴增凝膠電泳顯色利用已經存在的引物資源自己開發SSR引物58GAGAGAGAGAGAGAGAGAGenomicDNA①自主開發SSR引物文庫富集法enrichedlibraryGAGAGAGAGAGAGAGAGA59GAGAGAGAGAGAGAGAGA克隆到載體里HybridwithpolyGA/CT60選擇陽性克隆、序列測定GAGAGAGAGAGAGAGAGA61GGAAACAAAGTACTAGGTCCACCAAACTCTTCATTATGATACCTCATTAGTTGGATGAGGATAAATTATCTGATTTGCTGATTGGAAAGCTATTTCATTGTTCTCGAAGTTTCTACACCCAACACCCATATCCGACACATTTTCGGACATGTGCATGGAGATACGACCTCCAAGGATCCTCCAAATATATGAAAATACGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAAAGGTTGAACATACCCATACACTCACTCCCAAGTCCGAATAAGATAATTGGAAAGTGTAAGCAACCAAGTCCGAATAAGATAATTGGTAAGTGTCTGCTTCCTTTAGATGTATAACATTTTTCTATAGTGGTCAGCTCATCTATCTACTGCTTTATGCTGAAGGCAGGGTAGGTACAGATCAAGCAAAATATTAGCCCCAGCTTATATATTGAACATTGAAGTATTTTCCAGTTATATGCATCTATTTCTTTGTATTTTTCTTCTTCGGTTATGCATTCTAACTGGAAT/TA探針？62ESTs通過基因的表達產物mRNA(信使RNA)反轉錄為cDNA隨著植物EST計劃的實施，公共數據庫中的EST序列迅速增長從EST中開發SSR63NCBI網站公布的主要農作物的ESTs序列數作物

CropsESTs

數目No.ofESTs作物

CropsESTs

數目No.ofESTS小麥

Wheat587,846高粱

Sorghum208,197玉米

Maize449,319馬鈴薯

Potato193,332大麥

Barley394,847油菜

Oilseedrape45,906水稻

Rice386,487燕麥

Oat27,018大豆

Soybean355,863陸地棉

Uplandcotton23,89964TTGCATTGCAGACCATTTTGTCTTCAAATATACATGACTTGAATAATGGAAACAAAGTACTAGGTCCACCAAACTCTTCATTATGATACCTCATTAGTTGGATGAGGATAAATTATCTGATTTGCTGATTGGAAAGCTATTTCATTGTTCTCGAAGTTTCTACACCCAACACCCATATCCGACACATTTTCGGACATGTGCATGGAGATACGACCTCCAAGGATCCTCCAAATATATGAAAATACATAATAATAATAATAATAAAAAAAGGTTGAACATACCCATACACTCACTCCCAAGTCCGAATAAGATAATTGGAAAGTGTAAGCAACCAAGTCCGAATAAGATAATTGGTAAGTGTCTGCTTCCTTTAGATGTATAACATTTTTCTATAGTGGTCAGCTCATCTATCTACTGCTTTATGCTGAAGGCAGGGTAGGTACAGATCAAGCAAAATATTAGCCCCAGCTTATATATTGAACATTGAAGTATTTTCCAGTTATATGCATCTATTTCTTTGTATTTTTCTTCTTCGGTTATGCATTCTAACTGGAAAAATGAACTCCAGGTTAGCATAAAGTAGACAATTCCCTTCACTTT6566研究基因組表達區內不同SSR模體的密度67②PCR擴增PCR反應組分：DNA模板一對引物dNTPTaq酶Mg2+反應緩沖液ddH2O68④顯色瓊脂糖凝膠－－－EB染色聚丙烯酰胺凝膠－－－硝酸銀染色帶熒光分子的引物－－－熒光捕獲69CML60對DH962×冀棉5號F2群體的擴增圖BNL3655對DH962×冀棉5號F2群體的擴增圖70BNL2921對DH962×冀棉5號F2群體的擴增圖71SSR熒光標記72

SSR優點：一般檢測到的是單一的復等位基因位點，提供的信息量高孟德爾方式遺傳，呈共顯性，可鑒別雜合子和純合子所需DNA量少數量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態性高可檢測稀有重復基序通用性：SSR很保守，EST-SSR通用性強734、ISSR 用結合于兩個相鄰SSR區域內的引物去擴增它們中間的單拷貝序列747576用2個核苷酸、3個核苷酸或4個核苷酸序列為基元(motifs)，以其不同重復次數再加上幾個非重復的錨定堿基組成隨機引物如(AC)nX、(TG)nX、(ATG)nX、(CTC)nX、(GAA)nX等(X代表非重復的錨定堿基)(AC)nX：X＝C，T，G

ACACACACACACAACACACACACACA77(GA)8T

HBH(AG)7

(GA)8C

DVD(TC)7

(GA)8A

VHV(GT)7

(AG)8YT

HACT(AG)8YC

VACG(AG)8YA

RAG

YCT(CT)8RA

BCGT(CT)8RC

DAGT(CT)8RG

(ACC)6

(GATA)4

(GGAGA)3

787980818283開發費用降低可以在不同的物種間通用揭示的多態性較高精確度幾乎可與RFLP相媲美檢測非常方便

845、序列相關擴增多態性

Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism,SRAP

上游引物長17bp，5ˊ端的前10bp是一段填充序列，緊接著是CCGG，組成核心序列及3ˊ端3個選擇堿基，對外顯子進行特異擴增下游引物長18bp，5ˊ端的前11bp是一段填充序列，緊接著是AATT，組成核心序列及3ˊ端3個選擇堿基，對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增因不同個體、物種的內含子、啟動子及間隔區長度不同而產生多態性該標記具有簡便、穩定、中等產率、便于克隆測序目標片段的特點858687邯鄲208×Pima90及部分F2群體中的擴增圖886、Conservedorthologsets899091927、intronpolymorphism939495968、StartCodonTargeted(SCoT)Polymorphism

目標起始密碼子多態性基因的起始密碼子的附近序列是非常保守的，具有一致性SCoT標記的引物就是根據植物基因中的ATG翻譯起始位點側翼區域的保守性來設計。單引物可同時結合在雙鏈DNA的正負鏈上的ATG翻譯起始位點區域，從而擴增出兩結合位點之間的序列。9798Specificnucleotidesintheprimersequencewerefixed:theATGcodon(atpositions+1,+2,and+3),‘G’atposition+4,‘C’atposition+5,andA,C,andCatpositions+7,+8,and+9,respectively.99100101AFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms

（擴增片段長度多態性）CAPS:CleavedAmplifiedPolymorphicSequences

（擴增片段限制性酶切長度多態性）三、基于PCR與限制性酶切技術結合的標記102AFLP:擴增片段長度多態性1992年由荷蘭科學家Zabeau和Vos發展起來的一種檢測DNA多態性的新方法具有重要的實用價值，一出現就被Keygene公司以專利形式買下較其它分子標記有著明顯的優越性，因此迅速傳播開來，盡管它已受到了專利保護，但世界上很多實驗室都在努力探索在自己的研究中應用AFLP技術Zabeau和Vos不得不將其專利解密，并以論文形式正式發表出來103104105106限制性內切酶酶切一般應用兩種限制性內切酶在適宜的緩沖系統中對基因組DNA進行酶切，一種為低頻剪切酶(識別位點為六堿基的rarecutter)，另一種為高頻剪切酶(識別位點為四堿基的frequentcutter)利用雙酶切可產生更好的擴增反應，在凝膠上產生適宜大小的適于分離的片段，不同的內切酶組合及選擇性堿基的數目和種類可靈活調整片段的數目，從而產生不同的AFLP指紋107EcoRI為六堿基識別位點的低頻剪切酶，其他限制性酶如HindIII、PstI、SacI、ApaI

在AFLP中和EcoRI作用相同，但EcoRI更為常用MseI為四堿基識別位點的高頻剪切酶，MseI常用于富含AT的真核生物基因組DNA鏈的切割；同為四堿基識別位點的TaqI酶會產生擴增片段的不等分布，常出現在凝膠的上部；MseI會產生更小的限制性片段，在AFLP指紋分析中更為常用AFLP分析中常用的酶組合為EcoRI/MseI108理論上，應該得到3種酶切片段，且MseⅠ-MseⅠ片段較MseⅠ-EcoRI片段多但事實上在AFLP反應中，MseⅠ-EcoRI片段擴增較MseⅠ-MseⅠ片段優先原因可能是MseⅠ引物較EcoRI引物的融合溫度低，使得在該反應條件下MseⅠ-MseⅠ片段的擴增比MseⅠ-EcoRI片段困難MseⅠ-MseⅠ片段由同一引物擴增，末端出現反向重復序列，當引物融合時，末端堿基配對形成莖環結構，影響繼續擴增109酶切片段要經過連續2次PCR擴增，通過這樣兩步擴增反應使產生的擴增結果更清楚、重復性更好第1次PCR擴增被稱為預擴增反應(Pre-amplification)，所用的AFLP引物只含有1個選擇性核苷酸，選擇擴增性能較差，因此大量的擴增產物在凝膠中往往形成連續的一片預擴增反應條件與常規PCR反應條件大致相同110選擇性擴增的反應條件與普通PCR有所不同，主要不同之處是復性溫度，它是采用溫度梯度PCR其PCR開始于高溫復性(一般采用65℃，比常規PCR反應的復性溫度高10℃)以期獲得最佳選擇性以后復性溫度逐步降低，一直降到復性效果最好的溫度(一般是56℃)，然后保持在這個溫度下復性，完成其余的PCR循環周期111AFLP接頭是一種人工合成的雙鏈DNA,一般長度是14～18個核苷酸,由核心順序和內切酶位點特異順序兩部分組成在絕大多數真核生物基因組DNA中，EcoRI總是給予可靠的酶切結果，價格又便宜，而MseI可以產生比較小而穩定的酶切片段。因此，目前商品出售的AFLP試劑盒中用的是EcoRI接頭和MseI接頭112AFLP引物是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，一般長度為18-20個核苷酸，由核心順序(core)、內切酶位點特異順序(ENZ)和選擇性核苷酸順序(EXT)三部分組成AFLP引物除了含有能與接頭及酶切位點相互補的序列外，其3’末端還填加有1-3個選擇性核苷酸順序113CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAAEcoRIadapterGACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCATMseIadapterEcoRI+1primerGACTGCGTACCAATTC-AMseI+1primerGACGATGAGTCCTGAGTAA-C114EcoRIGACTGCGTACCAATTCNNNMseIGATGAGTCCTGAGTAANNNCOREENZEXT引物的核心序列115116擴增產物的凝膠電泳分析選擇性擴增產物一般在5%～6%的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE序列分析膠)上經過電泳分離，形成DNA指紋，凝膠經過干燥、放射性自顯影后即可進行結果分析117放射自顯影銀染TAG106：1068-1074118119120優點：信息量大缺點：要求質量高的DNA操作繁瑣，條件優化較難染色體聚集121CAPs(酶切擴增多態性序列)PCR-RFLP基本原理：利用已知位點的DNA序列資源（基因數據庫、基因組或cDNA克隆以及克隆的RAPD條帶等）設計一套特異的PCR引物(19-27bp)擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析122123124優點：引物與限制酶組合非常多，增加了揭示多態性的機會，而且操作簡便，可用瓊脂糖電泳分析在真核生物中，CAPs標記呈共顯性，即可區分純合基因型和雜合基因型所需DNA量極少結果穩定可靠操作簡便、快捷、自動化程度高125STS(序列標簽位點)STS是對以特異引物序列進行PCR擴增的一類分子標記的統稱STS引物的設計主要依據單拷貝的RFLP探針(長度為200-500bp)，根據已知RFLP探針兩端序列，設計合適的引物，進行PCR擴增RFLP-PCR126優點：共顯性遺傳很容易在不同組合的遺傳圖譜間進行標記的比較，是溝通遺傳圖譜和物理圖譜的中介特異序列的STS用來確定物理圖譜及DNA片段排序在染色體上的位置缺點：STS標記的開發依賴于序列分析及引物合成，成本仍顯太高127單核苷酸多態性

（SNP:Singlenucleotidepolymorphism）指由于基因組的某個位點上單個核苷酸的變異而產生的差異。DNA分子單個核苷酸的變異有堿基替換、插入和缺失等形式,而SNPs不包括堿基的插入與缺失根據人類基因組測序的結果，大約每隔191kb就會出現一個SNP，在人類總長為3×109的DNA序列中，大約有16~32×106個SNPs四、基于DNA芯片技術的分子標記128129兩個序列：可指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等遺傳群體：在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸且其出現頻率大于1%130131圖、核苷酸位點的多態性與序列1比較相同核苷酸（堿基）序列1缺失核苷酸（堿基）132AnSNPCausedLossofSeedShatteringDuringRiceDomestication1331341、SNPs

基本特性1）、雙等位型標記(dialleleicmarkers)：理論上,單堿基替換包括1個轉換C\T(G\A)和3個顛換C\A(G\T)、C\G(G\C)、A\T(T\A)等四種不同的類型頻率各不相等,其中轉換和顛換之比為2∶1,而且第三、第四種類型很少,幾乎無法檢出1352）、在DNA分子上分布不均勻多在CpG位點上發生C\T的轉換,約占總SNPs的25%，大多數的C是甲基化的,它能夠自發脫氨基產生T在轉錄序列中SNPs

的頻率低于非轉錄序列中SNPs

的頻率,而且轉錄區的SNPs非同義突變的頻率比其它突變類型的頻率要低得多3）、有很高的密度平均每1900個bp

就有一個SNP，密度上達到了基因組“多態位點”數目的極限人類染色體上3×109bp中SNPs總數可達300萬個1364）、具有遺傳穩定性基于單核苷酸的突變，突變率為10-9，與微衛星等重復序列多態性相比，具有更高的遺傳穩定性5）、SNPs

的檢測和分析易實現自動化雙等位型，只需+/-分析就可以確定，有利于發展自動化技術進行大規模的篩選或檢測1372、常用SNP分型技術酶切PCR-SSCP直接PCR檢測HRMDNA芯片138酶切139PCR-SSCP單鏈構象多態性（single-strandcompositionpolymorphism,SSCP）基本原理：單鏈DNA在凝膠中的遷移率除了與其長短有關外,更主要的是取決于DNA單鏈間所形成的構象在非變性條件下,DNA單鏈內部可以折疊形成具有一定空間結構的構象,這種構象由DNA單鏈的堿基排列順序所決定即便是相同長度的DNA單鏈都會因其堿基順序不同,甚至單個堿基的改變造成單鏈空間構象產生變化,引起單鏈在凝膠中電泳遷移率的差異,從而表現出多態性140141直接PCR檢測通用引物擴增包含SNP區域特異引物只能與其中的一種堿基互補含錯配堿基的序列只有一個產物否則有2個擴增產物142143HRMhighresolutionmeltingcurveHRM技術主要是基于核酸分子物理性質的不同。不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。HRM技術的基本原理就是根據熔解曲線的不同來對樣品來進行區分。144PCR的擴增子進行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過程中，擴增子逐漸解鏈，在到達熔解溫度（Tm）時，DNA鏈完全分開LCGreen是飽和的熒光染料，在進行HRM分析時，由于飽和染料占據了DNA雙鏈上每一對堿基上的空位，所以在雙鏈解鏈時，染料立即與雙鏈脫離，使得熒光信號發生較大的變化。145146DNA芯片147148149150五、基于RGA的分子標記RGA(resistancegeneanalog)，抗病基因類似物不同植物的不同抗病基因大都具有一些共同的保守序列

富含亮氨酸重復(leucine-richrepeat，LRR)

核苷酸結合位點(nucleotide-bindingsite，NBS)

絲氨酸／蘇氨酸激酶(serine-threonine

kinase，STK)151152 根據保守序列設計簡并引物用于分子標記分析作為RFLP探針PCR-高分辨率電泳AFLP-RGANBS-profilling1531、PCR-高分辨率電泳1541551562、AFLP-RGA根據保守序列設計簡并引物克隆測序，設計引物酶切、加接頭、擴增（AFLP引物+RGA引物）1573、NBS-profilling酶切－－加接頭－－擴增－－電泳158Adaptershortarm:5’-ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA-3’Adaptershortarm:5’-TGGGATCTATACTT-3’Adapterprimer:5’-ACTCGATTCTCAACCCGAAAG-3’159160六、基于反轉錄轉座子的分子標記真核生物中一類可移動因子，轉座需經過由RNA介導的反轉錄過程而得名可分為LTR反轉錄轉座子和非LTR反轉錄轉座子以高拷貝在植物界廣泛分布，可以通過縱向和橫向分別在世代之間和不同種之間進行傳遞，同一家族的反轉錄轉座子具有高度的異質性161162163SSAP

(sequencespecificamplificationpolymorphism)IRAP

(interretrotransposonamplifiedpolymorphism)REMAP

(retrotransposonmicrosatelliteamplifiedpolymorphism)RBIP

(Retrotransposonbasedinsertionpolymorphism)1641、SSAP由Waugh等(1997)根據AFLP而改進的首先要對基因組進行酶切，只是在進行選擇性擴增時，除了一個接頭同源引物外，另一個引物是根據反轉錄轉座子的LTR末端保守序列而設計擴增的多態性來源有三限制性位點及其兩側序列的變異LTR5’末端的變異,反轉錄轉座子插入位點的變異第一類變異是和AFLP所檢測的變異一樣，而后兩種變異都是由于反轉錄轉座子而產生1651661672、IRAP由Kalendar等(1999)所發明，用來檢測反轉錄轉座子插入位點間多態性的分子標記原理是根據反轉錄轉座子的LTR包含的保守序列而設計引物，這些引物在PCR過程中可以與LTR反轉錄轉座子的相應區域退火，從而擴增出相鄰的同一家族的反轉錄轉座子成員間的片段；也可根據反轉錄酶基因的相對保守序列設計引物進行擴增168反轉錄轉座子可以任意方向整合入基因組中，因此同一個反轉錄轉座子家族的兩個成員可以以三種形式而相鄰，即頭對尾，尾對尾和頭對頭對于后兩種形式，只需一個反向引物就可產生PCR產物，而對于前一種形式，則必須用5’和3’LTR兩個引物1691703、REMAP由Kalendar等(1999)所首次報道原理是根據反轉錄轉座子的LTR保守序列和微衛星序列設計引物，然后進行PCR，擴增出反轉錄轉座子與最接近的微衛星間的片段檢測反轉錄轉座子與簡單重復序列之間的多態性1711724、RBIP根據豌豆的反轉錄轉座子PDR1而設計的用PDR1的反轉錄酶基因片段對豌豆屬的一個基因組文庫進行篩選，找到包含有該反轉錄轉座子的克隆，然后對其進行測序，得到了包括反轉錄轉座子及其兩側序列的堿基順序173反轉錄轉座子一側的序列設為A，另一側設為E，反轉錄轉座子的保守序列設為C在沒有反轉錄轉座子存在的情況下，以A和E為引物，可以通過PCR擴增出產物如果有反轉錄轉座子插入該區域，則由于A和E之間距離太遠而無法擴增出產物，此時以C和E作為引物，則可以擴增出條帶174175分子標記發展趨勢由“anonymousmarker”向“functionalmarker”發展Gel-based向genotypebysequencing發展176177178179如何選擇分子標記研究對象的相關信息研究目的結果的可靠性和可重復性分子標記的遺傳特性費用時間180第五節、遺傳連鎖圖

geneticlinkagemap基因組內基因在染色體上線性排列圖以及多態性DNA標記相對位置的圖譜形態標記、、細胞學標記、生化標記、分子標記植物基因組有四種圖譜：

遺傳連鎖圖、物理圖、核苷酸序列圖和基因圖

181一、遺傳連鎖圖構建的基礎構建遺傳圖譜的依據是同源染色體減數分裂過程中會發生交換，交換的結果便使染色體上的基因發生重組兩個基因之間發生重組的頻率取決于它們之間的相對距離基因間的遺傳距離用重組率表示，1cM≈1％的重組率182183184185二、基因間的遺傳圖距(交換值)186Independentassortmentofunlinkedgenes187188(1-r)/2AB

(1-r)/2abr/2

Ab

r/2

aB

ab(1-r)/2AaBb

(1-r)/2aabb

r/2

Aabb

r/2

aaBb

189例:測交AaBbxaabbAaBbAabbaaBbaabbTotal觀察值1403832150360預期值90909090360總X2=

(O-E)2

E=(140-90)2+(38-90)2+(32-90)2+(150-90)2=135.19

90

90

90

90自由度為3，遠遠大于X32(7.81)190此RFLP標記是否與紫色種皮基因連鎖？遺傳距離是多少？0.5/10＝5％＝5cM191三點測交（three-pointtestcross）192193

a~b=18.5

a~c＋b~c＝6.5＋13.2

＝19.7

a~b<(a~c＋b~c)?

應加雙交換值

ab＝ac＋cb

＋2（ac）（cb）

18.5＋0.6×2＝6.5＋13.2＝19.7

a(V)c(Ct)

b(Cv)

13.26.5

圖a－c－b的順序和圖距

194以DH群體為例，作標記的連鎖圖及基因定位G抗感表型標記1帶型記載賦值122222222221211111111211121121111111111112122222222221標記2帶型121111111111111222222222221標記3帶型RrRRRRRRRRRRRRRrrrrrrrrrrrR記載賦值記載賦值親本后代株系

195連鎖分析

G與標記3共分離，1、2、3緊密連鎖，2在1和3之間M23G113322230123G3/251/252/25196作圖函數MapfunctionAmapfunctionisamathematicalrelationshipbetweenrecombinationprobabilitiesandmapdistancesmeasuredincentimorgans(cM)197交換干擾與作圖函數

Mapfunction

M=F(r)C

Comments

Morgan(1928)r0AbsenceofcrossoverHaldane(1919)

-(1/2)ln(1-2r)1Absenceofcrossoverinterference

Kosambi(1944)(1/4)ln[(1+2r)/(1-2r)]

2rCrossoverinterference

198重組率(r%)和遺傳距離(cM)的關系34.745.83073.654.921.210.11.0Kosambi

115.180.525.511.21.0Haldane454020101r(%)Mapfunction199三、遺傳圖譜構建主要環節選擇適合作圖的分子標記，根據遺傳材料之間的多態性確定親本組合建立作圖群體，即具有大量分子標記處于分離狀態的分離群體或衍生系群體中不同植株或品系的標記基因型的分析借助計算機程序建立標記之間的連鎖分析構建飽和連鎖圖200201P1×P2×P1(P2)F2

BC1DHLF3RILTissueCulture

F11、Mappingpopulations(Controlledcrosses)

BILIL202作圖群體分類暫時性分離群體：回交群體、F2群體以及其衍生群體如F2:3等F2群體包含的基因型種類全面，信息量大，作圖效率高，群體構建比較省時，不需很長時間便可得到一個較大的群體

但每個F2單株所提供的DNA有限，且只能使用一代（暫時性）。若F2分離群體是通過遠緣雜交而來的，則遠緣雜交親本后代向兩極瘋狂分離，標記比例易偏離3:1，限制了該群體的作圖能力203回交群體的配子類型較少，統計及作圖分析較為簡單

但提供的信息量少于F2群體，且可供作圖的材料有限，不能多代使用204205永久性分離群體：重組自交系群體(Recombinantinbredlines，RIL)，加倍單倍體群體(Doubledhaploid，DH)等RIL群體是由F2經多代自交一粒傳(Singleseeddescendant，簡稱SSD)使后代基因組相對純合的群體206207208209RIL群體一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同實驗室的協同研究，而且作圖的準確度更高永久性群體有兩方面特點：群體中各品系的遺傳組成相對固定，可通過種子繁殖代代相傳，可不斷地增加新的遺傳標記可以對性狀的鑒定進行重復試驗以得到更為可信的結果建立RIL群體相當費時，而且有的物種很難產生RIL群體

210DH群體是通過對F1進行花藥離體培養或通過特殊技術(如栽培小麥或栽培大麥與球莖大麥雜交獲得的雜種胚胎中源于球莖大麥的染色體逐步消失)而得到目標作物單倍體植株，再經染色體加倍而獲得加倍單倍體群體DH群體相當于一個不再分離的F2群體，能夠長期保存構建DH群體需組織培養技術和染色體加倍技術，由于DH群體個體數往往偏少，所提供的信息量常低于F2群體211親本選配原則直接關系到建立遺傳圖譜的難易程度，遺傳圖譜的準確性及適用性親本間的差異不宜過大，否則會降低后代的結實率及所建圖譜的準確度親本間適度的差異范圍因不同物種而異，多態性高的異交作物可選擇種內不同品種作雜交親本，而多態性低的自交作物則需選擇不同種間或亞種間品種作雜交親本212PopulationGenotypeCommentsBackcross(BC)1(A)Homozygous2(H)HeterozygousDouble-haploid(DH)1(A)Homozygous2(B)HomozygousRecombinedinbredline(RIL)1(A)Homozygous2(B)HomozygousF2

(codominantandtwoallele)1(A)Homozygous2(H)Heterozygous3(B)Homozygous2、分子標記分析213214PopulationCodominantlociDominantlociF2population1:2:13:1Backcrosspopulation1:1

1:1*RILpopulation1:11:1Segregationratioateachlocusinpopulation215遺傳圖繪制-分子標記的等位型式216遺傳圖繪制-F2基因型分析2172182193、構建遺傳圖譜的應用軟件軟件名稱及簡要介紹、操作系統、參考文獻及獲取軟件的網址信息:http:///soft/list.html

目前應用最為廣泛的作圖軟件之一http:///distrubution/software/mapmaker3220221四、高密度（飽和）DNA標記連鎖圖譜遺傳圖譜飽和度是指單位長度染色體上已定位的標記數或標記在染色體上的密度，通常用標記平均間距來表示相鄰標記最大距離：標記往往是非均一地分布在染色體上，標記間距會或大或小一個基本的染色體連鎖框架圖大概要求在染色體上的標記平均間隔不大于20cM222主效基因的定位：平均間隔要求在10~20cM或更小QTL定位：平均間隔要求在10cM以下基因克隆：目標區域標記的平均間隔在1cM以下223標記數與圖譜飽和度之間的關系標記間的平均距離標記間的最大距離若要將最大可能間距從10cM減小到5cM，則需要另外增加1000個標記，通過提高圖譜平均密度的方法來縮小最大標記間距是很困難的有針對性地在間隙區上尋找標記，或尋找該間隙所在區域上有差異的親本構建作圖群體沒有一種標記在基因組中分布是完全隨機的，往往需要采用多種標記手段224群體大小與作圖精度的關系隨機分離結果可以辨別的最大圖距兩個標記間可以檢測到重組的最小圖距用于基因組的序列分析或基因分離等工作，則需用較大的群體，以保證所建連鎖圖譜的精確性構建分子標記骨架連鎖圖可基于大群體中的一個隨機小群體(如200個單株或家系)，當需要精細地研究某個連鎖區域時，再有針對性地在骨架連鎖圖的基礎上擴大群體群體的類型與作圖精度的關系

F2>RIL>BC1和DH225五、分子標記（圖譜）與作物改良品種鑒定品種保護育種的親本選擇種質資源的保存和利用基因（QTL）定位圖位克隆基因分子標記輔助選擇226玉米不同品種聚類227228QTLeQTLpQTL基因定位229第六節質量性狀基因的定位最好的標記是基因本身緊密連鎖的標記230Genotypeandphenotype…

Johannsen:Coinedtheterms“genotype”&“phenotype”instudyofgeneticandenvironmentaleffectofbean231表現型(phenotype)：

生物體所表現的性狀，如紅、白花等基因型(genotype)：

生物體所表現的性狀的遺傳基礎，或個體的基因組合，如CC,cc等雜合體與純合體(heterozygosity&homozygosity)：

相同位點上具有相同等位基因（純合基因型）的個體為純合體，等位基因不同為雜合體232性狀基因總會與某些標記連鎖若標記覆蓋整條染色體High-densitygeneticmaps233Good-fitnesstest(x2=1.802,P>0.1)indicatesthattheresistanceofMinghui63wascontrolledbyasingledominantgene.Theor

ApplGenet(2003)106:1467–1472234235Map-basedcloning236質量基因的定位近等基因系分析法分離集團混合分析法1