體外放射分析法體外放射分析法類型一、競爭性分析：

放射免疫分析法（RIA），標記抗原二、非競爭性分析：

免疫放射分析法（IRMA），標記抗體體外放射分析法放射免疫分析一、基本原理：

限量標記抗原（*Ag）和可變量的待測的非標記抗原（Ag）與定量的特異性抗體（Ab）發生競爭結合反應，通過測定復合物的放射性來計算出待測非標記抗原的含量。*AgAgAb*Ag-AbAg-Ab*Ag＋＋體外放射分析法放射免疫分析標準曲線常用的三種作圖法體外放射分析法二、RIA試劑盒的必備條件：1、抗體：

多克隆抗體與單克隆抗體理想的抗體：高親和力、高特異性、高滴度體外放射分析法放射免疫分析技術所用抗體質量的三種主要指標親和力測定交叉反應測定滴度的檢測體外放射分析法（1）親和力

（2）交叉反應

（3）滴度檢測：大分子抗原——125I小分子——3H或接一個大分子蛋白質，常用牛血清白蛋白，再125I標記125I標記：每個蛋白分子小于1個125I原子3H標記：每個蛋白分子可1~4個3H原子2、標記抗原：●標記率、比活度●放化純●T1/2不能太短：125I59.7天3H●不改變原有抗原特性（特異性、親和力、免疫活性等）體外放射分析法3、標準品或校準試劑：4、質控樣品：

標準品是定量的依據，要求純度盡量高，配制時濃度要準確。

免疫活性與待測抗原相一致（平行試驗）高、中、低三種；

質控標本為血清，用PBS稀釋，是提純抗原；

用“0”血清稀釋，“0”血清可用混合血清；

用活性炭等處理；體外放射分析法（1）液相分離劑：

a、雙抗體沉淀法；

b、PEG沉淀法；

c、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法；

d、活性炭吸附法：測上清液

e、微孔濾膜過濾法

f、其它：如鹽析法、層析法、電泳法等5、分離試劑和材料：體外放射分析法（2）固相分離劑：

材料：如塑料、纖維等，凝膠顆粒等

具備條件：

a、吸附牢固；

b、不影響抗體免疫活性；

c、NSB低；

d、吸附材料的理化性質穩定；

e、吸附材料價廉易得；體外放射分析法三、測定方法1、加樣：

（1）經典加樣法；

（2）順序加樣法：

Ab+待測Ag*Ag

測小分子抗原可提高靈敏度，但穩

定性、重復性較差

2、孵育：

3、分離結合與游離部分：

4、測放射性：

5、數據處理：體外放射分析法四、評估RIA試劑盒的

主要技術指標1、靈敏度：

該試劑盒的最低檢測值

RIA：0管的結合率-2SD

IRMA：0管的結合率+2SD

2、準確度：

指樣品測定值偏離真值的程度

回收試驗：95~105%體外放射分析法3、精密度：

同一樣品重復測定的實測劑量的離散程度

CV=SD/均數×100%

批內＜10%；

批間＜15%

ABCV：

一批試驗的平均CV（為各樣品CV的平均值體外放射分析法

如兩批樣品的含量一高一低，ABCV就缺乏可比性，就必須作精密度圖：體外放射分析法4、特異性：

主要指抗體的特異性

5、非特異結合率：

PEG＜10%

雙抗或固相＜5%

6、劑量-反應曲線和工作范圍：體外放射分析法改變抗體滴度對標準曲線不同區段斜率（A）及精密度圖（B）的影響體外放射分析法五、RIA的質控1、目的：

質控是對分析工作的誤差進行經常性檢查，遇到有質量異常則及時采取對策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內（QC）。體外放射分析法2、內容：

試驗誤差：隨機誤差和系統誤差

（1）標準曲線質量；

（2）精密度檢驗；

（3）整批試驗的偏差；

（4）漂移；

（5）批間質控；體外放射分析法精密度、偏差和準確度三者關系示意圖體外放射分析法Schewart圖Cusum圖體外放射分析法其他放射免疫分析放射受體分析法；

放射競爭蛋白結合分析法；

放射酶分析法；體外放射分析法免疫放射分析一、基本原理：

免疫放射分析法（IRMA）是用過量的放射性核素標記的抗體（*Ab）和限量的抗原或半抗原（Ag）結合，形成Ag*Ab、其放射性和所加Ag的量呈正相關。Ag+*AbAg*Ab

體外放射分析法二、IRMA的特點：1、屬于非競爭性抗原抗體結合反應；

2、抗原抗體復合物的量與所加非標記抗原量呈正相關；

3、在低劑量區不會有不確定因素，靈敏度較高；

4、IRMA的NSB對低劑量區影響大；

5、RIA低劑量區的放射性高，NSB主要影響高劑量區，IRMA相反，影響低劑量區；體外放射分析法三、IRMA的試劑：1、標記抗體；通常是單克隆抗體。

2、標準品；

3、分離試劑：固相抗體

4、質控；體外放射分析法四、IRMA的基本方法：1、雙抗體夾心法：

Ab1——Ag——*Ab2

2、標記第三抗體法：

Ab1——Ag——Ab2——*抗Ab2

3、生物素標記抗體：

Ab1——Ag——生物素標記Ab2——125I標記親和素特點：每一抗體分子可以連接幾十個分子生物素，提高靈敏度。體外放射分析法五、IRMA的實際應用中的特點：1、標記物的穩定性：標記抗體

2、反應動力學：

標記抗體過量，反應容易達到平衡

3、分析靈敏度：高體外放射分析法4、可測量的劑量范圍寬；IRMA和RIA精密度圖的比較5、特異性高；兩個抗體6、加樣誤差??；關鍵是Ag體外放射分析法五、IRMA的不足之處：

兩株抗體，針對不同抗原決定簇，要求被測抗原至少有12~16個氨基酸組成有特征性的序列（6~8個氨基酸決定一個抗原決定簇）。

主要測定肽類和蛋白質，半抗原不能應用。體外放射分析法非放射性標記免疫分析優點：

1、有些技術能提高靈敏度和穩定性；

2、反應迅速，縮短測定時間，提高工作效率；

3、能執行全自動化；

4、減少誤差，提高質控水平；

5、有效半衰期較長；

6、從免疫分析的角度說，非放射性與放射性分析技術的原理是相同的，只是以酶、熒光、發光等代替125I，最后信號不是放射線而是其他物理形式。體外放射分析法一、酶標記免疫分析法：固相Ab1——Ag——酶標記Ab作用于酶底物，產生光吸收物質、熒光物質或化學發光。體外放射分析法1、酶聯免疫吸附分析法（ELISA）原理：

在抗體分子上連接酶分子，代替放射性標記的抗體，進行與IRMA相似的夾心免疫反應。反應結束后，分離結合、游離部分，取結合部分，利用酶的催化活性，由結合部分上的酶將特定的底物轉化為特定的顏色，顏色的深淺與酶的量呈正比。體外放射分析法2、酶免疫熒光分析法將酶反應的底物改為熒光物質→光子激發→熒光體外放射分析法二、發光免疫分析法：采用化學發光物質作為標記物化學發光免疫分析（CLIA）酶增強發光免疫分析（ECLEA）電化學發光免疫分析（ECLIA）體外放射分析法1、化學發光免疫分析法（CLIA）原理：

發光物質標記抗原或抗體，標記的發光物質通過氫化反應獲得能量，處于激發態，當其返回基態時以光子形式釋放能量，其發光強度與被測物質濃度相關。體外放射分析法固相Ab1——待測Ag——化學發光物質標記Ab氧化等反應——發生化學反應——光子。發光物質：1、異魯米諾；2、丫啶酯類；3、苯酚類；

4、咪唑類；5、苯基草酸酯類體外放射分析法2、酶增強發光免疫分析法（ECLEA）原理：

將化學發光物質作為酶的發光底物，由酶觸發化學發光物質激發過程，產生光子。酶：1、辣根過氧化酶系統；

2、堿性磷酸酶系統；體外放射分析法以DPC公司為例：AMPPD中間體減去一個磷酸基裂解金剛烷酮間氧苯酯陰離子（激發態）基態光子體外放射分析法3、電化學發光免疫分析法（ECLIA）原理：是一種在電極表面由電化學引起的發光反應。三聯吡啶釕+三丙胺（TPA）電場陽極面氧化反應（失去一個電子）TPA氧化成陽離子自由基，失去一個質子，形成一種強還原劑三價三聯吡啶釕二價（強氧化劑）激發態光子*三聯吡啶釕無消耗，僅消耗TPA體外放射分析法三、熒光免疫分析法：

該反應系統不使用酶，而用熒光物質標記抗原或抗體進行分析。1、熒光偏振分析技術（FPIA）；2、時間分辨熒光免疫分析技術（TrFIA）；銪（Eu）標記抗體+待測Ag——形成復合物酸性條件下Euˉ熒光弱信號增強液β-二酮體新的螯合物持續且強的熒光信號在此反應中，自然本底熒光衰變4~10ns，而Eu3+的熒光衰變為4.3×105ns體外放射分析法RIA與化學發光的比較RIA存在以下不足：1、標記物的穩定性；2、反應時間過長；3、放射性計數有自身漲落；4、人工操作存在誤差；5、不能進行全自動化操作；6、藥盒有效期短；化學發光的優點：1、非放射性分析；2、靈敏度高；3、穩定性好；4、檢測速度快；5、全自動化；6、半衰期長；體外放射分析法受體放射配基結合分析一、基本原理：

用放射性核素標記配基與相應的受體進行特異性結合，測定復合物的放射性活度，從而對受體進行定性和定量。R+LRLK1,v1K2,v2R為游離受體；L為游離配基的濃度RL為復合物濃度K1為結合速率常數，k2為解離速率常數體外放射分析法1、飽和曲線：2、競爭抑制曲線：

若受體和放射性配基的結合反應系統中另加入該受體的非標記配基，則后者會與放射性配基競爭受體體外放射分析法一、基本條件：1、受體標本：

（1）分離亞細胞組分；（2）完整的活細胞；（3）組織切片；2、標記配基：

（1）高比活度；（2）高親和力；（3）高特異性；（4）高放化純度；體外放射分析法3、非標記配基：

（1）測NSB；（2）競爭結合反應中作為競爭劑；4、結合反應類型：

（1）多點飽和曲線；（2）單點法；5、反應的環境條件：（1）PH、Buffer；（2）溫育溫度和時間；（3）反應體積；6、分離結合和游離部分：體外放射分析法臨床意義：1、內分泌系統：

（1）甲狀腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TGAb、TMAb、TPOAb、Tg、TRAb；（2）糖尿?。阂雀咛撬?、胰島素、C肽、生長抑素、IAb、IcAb、GAD；（3）腎上腺：皮質醇、ACTH；（4）生殖系統：FSH、LH、T、P、E2、PRL、HCG、β-HCG；2、垂體系統：

ACTH、TSH、LH、FSH、PRL、HGH、ADH、……體外放射分析