第2節

微生物的培養技術及應用01一生物的基本培養技術（第2課時）第1章發酵工程（三）微生物的純培養1.相關概念：培養物？純培養物？純培養？（P11）2.酵母菌的純培養的基本步驟？（注意倒平板和接種的具體操作）3.什么是菌落？（P12）4.獲得單菌落的方法？（P12）【自主探究】請同學們閱讀教材P11-12，完成以下問題：

接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體。由單一個體繁殖所獲得的微生物群體。過程包括

、

、

、

和

等步驟。培養物純培養物純培養配制培養基滅菌接種分離培養單個細胞微生物群單個菌落連續劃線

稀釋分散生長繁殖微生物的純培養酵母菌的純培養微生物群分散或稀釋單個細胞繁殖單菌落(1)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落(2)單菌落：一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。(3)獲得單菌落的方法：稀釋涂布平板法、平板劃線法1.實驗原理稀釋涂布平板法平板劃線法酵母菌的純培養

2.目的要求

(1)學會配制培養酵母菌的培養基并倒平板。

(2)學會進行無菌操作。

(3)嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。

3.材料用具①酵母菌培養液、馬鈴薯、葡萄糖(或蔗糖)、瓊脂、蒸餾水②天平，小刀，紗布，燒杯，錐形瓶，棉塞、牛皮紙（或報紙）③皮筋，培養皿，接種環，酒精燈，超凈工作臺④高壓蒸汽滅菌鍋，干熱滅菌箱和恒溫培養箱等稱取去皮的馬鈴薯200g切成小塊加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛。用紗布過濾得到濾液濾液中加入20g葡萄糖，15~20g瓊脂。用蒸餾水定容至1000mL4.實驗方法步驟：配制培養基4.實驗方法步驟：配制培養基滅菌將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞。包上牛皮紙，并用皮筋勒緊。壓力100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15~30min。取5~8套培養皿培養皿疊成一束用幾層牛皮紙包緊放入干熱滅菌箱內，160~170℃滅菌2h。培養基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板：1拔出錐形瓶的棉塞。3用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基倒入培養皿（10～20mL），立即蓋上皿蓋。4等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒過來放置。2將瓶口迅速通過火焰。通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基不能完全打開，以免雜菌污染培養基防止皿蓋上冷凝水落入培養基造成污染。避免培養基的水分過快的揮發。4.實驗方法步驟：配制培養基滅菌倒平板4.實驗方法步驟：配制培養基滅菌倒平板如果需要調節培養基的pH，應該在定容完成后，滅菌之前進行操作。1.培養基pH要適宜，調pH是在滅菌前還是滅菌后？問題思考與分析：2.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？

將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。3.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？

最好不要用這個平板培養微生物。

防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。計算稱量溶化定容調PH滅菌倒平板瓊脂是一種多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板時，高于50℃則會燙手，若低于50℃不及時操作，瓊脂會凝固。7.為什么倒平板時，將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能完全打開？防止雜菌污染培養基4.培養基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時開始倒平板？6.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。問題思考與分析：8.為什么倒平板和接種整個過程要在酒精燈火焰旁進行？酒精燈火焰附近是無菌區域，避免周圍環境中的雜菌污染9.倒平板時為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。問題思考與分析：10.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。11.在滅菌前，用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養基的錐形瓶的目的是什么？在滅菌時能避免水蒸汽凝結時浸濕棉塞；在取出培養基錐形瓶時也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。4.實驗方法步驟：接種和分離酵母菌——平板劃線法

通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經過數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。連續劃線法分區劃線法034.實驗方法步驟：接種和分離酵母菌——平板劃線法平板劃線的具體操作步驟①將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環的金屬絲燒紅。②在火焰旁冷卻接種環，并拔出裝有酵母菌的棉塞。③將試管口通過火焰④將已冷卻的接種環伸入菌液中，蘸取一環菌液。⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基。⑦灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最后一區的劃線與第一區相連。4.實驗方法步驟：接種和分離酵母菌——平板劃線法平板劃線的具體操作步驟12345灼燒接種環蘸取菌液第1區接種灼燒接種環第2區接種灼燒接種環第3區接種第5區接種注意：①接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次。②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環進行滅菌；在5個區域劃線，接種環灼燒滅菌共6次。劃線操作結束后，仍需灼燒接種環。④劃線后,培養皿倒置培養平板劃線法可以對菌種進行分離，能否對培養液中菌種進行計數呢？不能計數警示：在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環境。4.實驗方法步驟：培養酵母菌

完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃（培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）左右的恒溫培養箱中培養24-28h。劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）1.在未接種的培養基表面是否有菌落生長?如果有,說明了什么?2.在接種酵母菌的培養基上,你是否觀察到了單菌落?這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致?如果你觀察到了不同形態的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎?3.你是如何記錄實驗結果的?請與其他同學交流、互評。提示1：在未接種的培養基表面應該沒有菌落生長；

如果有，說明培養基被雜菌污染。提示2：如果觀察到了不同形態的菌落，可能是接種的菌種不純或無菌操作不規范等原因引起的。5.結果分析與評價酵母菌的純培養1.為什么在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時,仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結束后殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞。殺死接種環上原有微生物問題思考與分析：2.在灼燒接種環之后，要等其冷卻再進行劃線，目的是什么？避免溫度過高殺死菌種使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落①一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；②存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落5.為什么劃線時要注意不能劃破培養基？3.除第一次劃線外，每次劃線都從上一次劃線的末端開始，目的是什么？6.未接種的培養基直接培養起什么作用？做空白對照，若培養后培養基表面無菌落，則說明培養基沒有污染。

用以確定培養基滅菌是否徹底問題思考與分析：4.為什么最后一次劃線與第一次的劃線不能相連？最后一次劃線已經將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則增加了細菌的數目，達不到純化的效果。有一段時間，水果“酵素”風靡各地。水果“酵素”制作的大致過程是：將洗凈、切成塊狀的水果放入潔凈的容器，再加入糖和水，密封，置于陰涼處發酵一至兩周。有人說，吃水果“酵素”可以美容、減肥、促進消化和提高免疫力。請評估這一論點是否可信。追問以下問題可以幫助你分析。水果“酵素”是什么？其制作原理是什么？其中可能含有哪些成分？其是否含有人們無法從其他食品中獲取但又是維護健康所必需的成分？其中的所有成分都有益于人體健康嗎？酶的另一種說法。其制作是利用微生物進行無氧呼吸的原理，進行像制作泡菜一樣的發酵。其中可能有糖類（包括一些簡單的糖和膳食纖維等）、蛋白質（包括多種酶）、有機酸等成分。不存在它獨有的、特殊的營養物質。其中甚至可能含有微生物發酵產生的有毒物質，食用后可能會危害人體健康。酵母菌的純培養2.接種和分離酵母菌1.制備培養基3.培養酵母菌①配制培養基（馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、水）②滅菌③倒平板（在酒精燈火焰附近操作）培養基：濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌鍋）培養皿：干熱滅菌（干熱滅菌鍋）用接種環在固體培養基上用平板劃線法接種平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養箱培養酵母菌純培養小結微生物的純培養03(1)培養基分裝到培養皿后再進行濕熱滅菌()(2)倒平板時，應將打開的皿蓋放到一邊，以免培養基濺到皿蓋上()(3)配制培養基時應先滅菌再調pH()×××配制培養基時應先調pH再滅菌；先進行濕熱滅菌，再在無菌環境中將其分裝到培養皿中；將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基倒入培養皿，立即蓋上皿蓋；2.下列接種過程，正確的順序是

。b、a、e、f、c、g、d微生物的純培養031.微生物的純培養既需要適宜的培養基，又要防止雜菌污染。（1）培養基中的營養物質濃度越高，對微生物的生長越有利。（）（2）消毒和滅菌的殺菌程度存在差異。（）（3）微生物的純培養物就是不含有代謝廢物的微生物培養物。（）×√×練習與應用一、概念檢測2.日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低溫儲存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通過食鹽、糖等制造高滲環境，從而抑制微生物的生長和繁殖；低溫則是通過降低微生物的代謝速率來抑制微生物的生長和繁殖。

1.某同學將5個手指尖在貼有“洗手前”標簽的培養基上輕輕按一下。然后用肥皂將該手洗干凈，再將5個指尖在貼有“洗手后”標簽的同種培養基上輕輕按一下。將這兩個培養皿放入37℃恒溫培養箱中培養24h后，發現貼有“洗手后”標簽的培養皿中菌落較少。請分析回答下列問題。（1）這個實驗中需要進行滅菌處理的材料用具有：（2）“將指尖在培養基上輕輕按一下”相當于微生物培養中的哪一步操作？（3）從實驗結果來看,洗手后我們就能進行無菌操作了嗎？操作時，我們可以采用什么方法來避免手上微生物的污染？提示（1）：培養皿和培養基。提示（2）：接種。（3）提示：通過實驗結果可以看到，洗手后手上還有一些微生物，不能直接進行無菌操作?？梢酝ㄟ^用酒精棉球擦拭雙手，或戴消過毒的手套等方法來避免手上微生物的污染。二、拓展應用練習與應用

2.某生物興趣小組將從葡萄皮上成功分離來的野生酵母菌分別接種于3個盛有等量同種液體培養基的錐形瓶中，并放置在搖床上培養，搖床轉速分別為210r/min，230r/min和250r/min。培養時間與酵母菌種群密度的關系如下圖所示。請分析回答下列問題。（1）搖床轉速不同,意味著培養條件有什么不同？提示：意味著培養液中02含量不同。（2）從圖中數據你可以得出什么結論?其原因是什么?提示：培養液中02含量越高,酵母菌種群密度越大。（3）為什么培養8h后，其中2個錐形瓶中酵母菌的種群密度基本達到穩定?提示：這時候已經達到了環境容納量。二、拓展應用練習與應用第2節

微生物的培養技術及應用二微生物的選擇培養和計數

自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合的菌群中不是優勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。該怎么辦呢？閱讀課本16頁第2段，通過尋找耐高溫的DNA聚合酶，明確可以篩選出來的原因，這為實驗室篩選微生物提供什么提示？說出選擇培養基的定義。

1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌(Thermusaquaticus)，進而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應(PCR)。

這是因為水生棲熱菌能在

70-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。討論1.為什么水生棲熱菌能從熱泉中被篩選出來呢？2.以上例子給我們在分離純化微生物帶來什么啟示？

實驗室中，人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長，從而篩選特定的微生物。根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。

人為提供有利于目的菌生長，同時抑制或阻止其他微生物生長的條件，進行實驗室微生物的篩選。選擇培養基耐寒微生物石油分解菌被石油污染的土壤冰川凍土層類型條件分離得到的菌種改變培養條件70～80℃的高溫添加某種化學物質加入青霉素高濃度食鹽特殊碳、氮源石油是唯一碳源營養缺陷不加碳源不加氮源水生棲熱菌酵母菌、霉菌等真菌金黃色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自養型微生物固氮菌（1）原理：人為提供

目的菌生長的條件(包括

、

和

等)，同時

其他微生物的生長。（2）概念：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。有利于營養溫度pH抑制或阻止（3）實例：一、選擇培養基培養基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落長出各種各樣的細菌培養基+氨芐青霉素沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?培養基那么如果讓你分離土壤中分解尿素的細菌，你應該怎么設計呢？一、選擇培養基尿素的立體結構尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3

在選擇培養基中，以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌才能生長發育繁殖。1.如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？除以尿素作為唯一氮源外，該培養基的其他營養成分與普通培養基基本相同。選擇培養基配方的設計討論選擇培養基配方的設計培養基配方KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml3.為了從土壤中分離出分解尿素的細菌，某同學設計了如圖的選擇培養基。怎么證明該選擇培養基具有選擇性呢？提供無機鹽凝固劑提供氮源提供碳源若基礎培養基或完全培養基中生長的菌落數菌幾乎等于該選擇培養基，該選擇培養基不具有選擇性。應該設置完全培養基作為對照，若完全培養基中生長的菌落數多于該選擇培養基，則該選擇培養基具有選擇性。1.從物理性質來講，兩者屬于_____培養基，判斷依據是_________________________________；該類培養基的主要用途為____________________________；2.從用途上來講，培養基二屬于______培養基，目的是為了獲得_____________________；3.兩種培養基共有的培養基成分有：________________________；培養基一的碳源主要為________，氮源主要為________；培養基二的碳源為________，氮源為________。培養基一牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000ml培養基二KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml固體添加了凝固劑瓊脂，且比例為1.5%~2%分離、鑒定、計數、保存選擇能分解尿素的微生物碳源、氮源、無機鹽、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素學以致用4.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？方法:稀釋涂布平板法基本操作:A、梯度稀釋菌液B、涂布平板將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。稀釋度足夠高時，能在培養基表面形成單個菌落。對土壤進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養基上。

(2)由于土壤細菌的數量龐大，那么怎么獲得要想得到特定微生物的純培養物呢？思考(1)1g土壤中有多少能分解尿素的細菌？分離：獲得分解尿素的細菌的純培養物計數：測定分解尿素的細菌的數量二、微生物的選擇培養可否直接制備土壤溶液，利用平板劃線法接種到選擇培養基上，進行培養計數？為什么？不能。①平板劃線法最開始的劃線細菌可能會長成一片，導致無法計數，②灼燒接種環的時候也會殺死一部分細菌，導致計數偏小。平板劃線法稀釋涂布平板法注：通過統計平板上的

，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。菌落數請同學們觀看稀釋涂布平板法操作視頻，小組合作思考討論稀釋涂布平板法的具體操作過程。

細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3~8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。操作步驟:1.土壤取樣取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。注意二、微生物的選擇培養1.鏟取土樣的鐵鏟和紙袋是否也需要滅菌？為什么？需要；因為也會造成雜菌污染，影響實驗結果。2.樣品的稀釋（梯度稀釋菌液）1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無菌水90mL無菌水10g②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。二、微生物的選擇培養2.將10g土樣加入盛有90mL無菌水，代表稀釋多少倍？10倍。表述：①稀釋

倍的稀釋液；②稀釋

的稀釋液；10n10-n微量移液器3.涂布平板③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。

待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入恒溫箱培養。注意：各梯度分別涂布3個平板（重復實驗）和1個不涂布作空白對照。二、微生物的選擇培養涂布結束后，要將涂布器灼燒滅菌。1.10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已稀釋10倍。計算時，不要忽略；2.由于使用的是選擇培養基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因為有些微生物可以利用目的菌的代謝產物來生長繁殖，所以還需要進一步驗證；3.過程中所有操作都應在酒精燈火焰旁進行；4.將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。特別提醒4.培養與觀察稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照恒溫培養箱待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養箱中，培養1-2d。二、微生物的選擇培養

1.培養時要將一個未接種的培養基和一個已接種的培養基放在一起培養，為什么？培養未接種的培養基的作用是對照。

2.未接種的培養基表面是否有菌落生長很關鍵，如果無菌落生長，說明了什么？未接種的培養基在恒溫箱中保溫一段時間后，如果無菌落生長，說明培養基制備成功、合格，未受到污染。二、微生物的選擇培養稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照在涂有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。主要方法稀釋涂布平板法平板劃線法主要步驟系列梯度稀釋操作和涂布平板操作接種環在固體培養基表面連續劃線接種工具涂布器接種環菌體獲取從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體在具有顯著的菌落特征的區域挑取菌體能否用于計數可以計數，但是操作復雜，需涂布多個平板不能計數共同點都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可以觀察菌落特征。比較稀釋涂布平板法和平板劃線法常用微生物分離方法比較比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具接種環涂布器原理在數次劃線后培養，可以分離到由一個細菌細胞繁殖而來的肉眼可見的細胞群體，即菌落。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細菌細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落。特點方法簡單，但不適宜計數單菌落更易分開，可以計數，但操作復雜。結果共同點使培養基上形成由單個細菌細胞繁殖而來的子細胞群體——菌落二、微生物的選擇培養1.統計的是細菌數還是菌落數？2.選擇數目為多少的平板進行計數？3.同一稀釋度至少取幾個平板？4.為什么統計的菌落往往比活菌的實際數目低？5.如果其中有一個平板的計數結果與另2個相差較大（230、34、240），應該

如何處理？計數原則和結果分析:（教材P18）當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。如實記錄，求平均值時舍去。應找出原因并重新實驗1.間接計數法——稀釋涂布平板法三、微生物的數量測定（1）原理

當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照（2）計數原則①

一般選擇菌落數為30～300的平板計數。②

在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。③

適當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。三、微生物的數量測定1.間接計數法——稀釋涂布平板法（1）原理

當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。→重復實驗的目的：減小實驗誤差，增強實驗的說服力和準確性。菌落數太多會過于密集導致菌落重疊難以準確計數，菌落數太少容易因偶然性導致統計誤差較大。分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。1.間接計數法——稀釋涂布平板法原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。（4）計算公式每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；M代表稀釋倍數。V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；（5）使用范圍

可以用來測定土壤、水、食品等樣品中的細菌、酵母菌、芽孢和孢子等的數量，但不適于測定樣品中的放線菌、絲狀真菌等絲狀體微生物的數量。三、微生物的數量測定（3）結果分析①統計的菌落數往往比活菌的實際數目少；②統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。

因此，統計結果一般用

而不用活菌數來表示。菌落數

、

是成功統計菌落數目的關鍵。恰當的稀釋度涂布是否均勻例1.某同學在稀釋倍數為106的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每克樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4B學以致用練：甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個某兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果：甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230；乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統計結果。請評價這兩位同學的實驗結果的有效性：1.甲同學________________________________；2.乙同學_____________________________________________；實驗操作不合理，未設置重復實驗組結果計算不合理，21與另外兩組數值相差太大，應舍去學以致用某同學對1×101、1×102、1×103倍稀釋液計數的平均菌落數分別是2760、295和16，則菌落總數為（所用稀釋液體積為0.1?mL）(

)A.2.76×104個/mL

B.2.95×105個/mLC.4.6×104個/mL

D.3.775×104個/mLB①統計結果一般是_________________，不能區分死菌與活菌。②個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。③不適于對運動細菌的計數。利用特定的__________或____________在______下觀察、計數，然后再計算________的樣品中微生物的數量；

*血細胞計數板——較厚，常用對相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等；

細菌計數板——較薄，可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。細菌計數板血細胞計數板顯微鏡一定體積快速、直觀活菌數和死菌數的總和偏大三、微生物的數量測定2.直接計數法——顯微鏡直接計數（1）原理（2）優點（3）缺點設備簡單；能觀察微生物的形態特征。計數區放大后的計數室（4）計數方法：每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數注意：統計結果一般是活菌數和死菌數的總和?！叭旧懦ā保杭尤肱_盼藍染液（活菌-無色）三、微生物的數量測定2.直接計數法——顯微鏡直接計數方格網上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數室，供計數用。中方格16個每個中方格有小方格25個大方格邊長為1mm，深度為0.1mm1個計數室有

個小方格。1個計數室的體積為

mm3=

ml1mL培養液所含菌數＝每小格平均菌數×400×104×稀釋倍數血細胞計數板0.14001×10-4內容直接計數法間接計數法主要用具計數依據優點缺點計算公式結果顯微鏡、細菌計數板或血細胞計數板涂布器細菌個數培養基上菌落數計數方便、操作簡單計數的是活菌不能區分死菌與活菌操作較復雜且有一定誤差每毫升原液含菌株數＝400×10000×每小格平均菌株數×稀釋倍數每毫升原液含菌株數＝平均菌落數/所用涂布液體積×稀釋倍數三、微生物的數量測定微生物的計數方法比較比實際值偏大比實際值偏小微生物的選擇培養與計數(1)以尿素為唯一氮源的培養基是選擇培養基()(2)脲酶能催化尿素分解產生N2，N2可作為細菌生長的氮源()(3)利用顯微鏡直接計數法統計的細菌數量就是活菌的數量()√×NH3,NH3可作為細菌生長的氮源。×死菌和活菌的總數?！就寥乐蟹纸饽蛩氐募毦姆蛛x與計數】1.取樣的土壤要符合哪些要求才能獲得更多的細菌？取樣的部位是？2.測定土壤中細菌的總量和能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？為什么？3.在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？4.為什么要選取菌落穩定時的記錄作為結果？5.在以尿素作為唯一氮源的培養基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？閱讀教材P18~P19內容，思考并解決以下問題：(5min)三、微生物的數量測定（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌（2）統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用

的_____培養基，可以從土壤中分離出

的細菌。脲酶以尿素作為唯一氮源選擇分解尿素CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶1.實驗目的2.實驗原理

常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】土壤取樣制備培養基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養與觀察3.實驗步驟①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。

（細菌適宜在該環境中生長）②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。

（細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。）

3.實驗步驟（1）土壤取樣注意事項：取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手?！就寥乐蟹纸饽蛩氐募毦姆蛛x與計數】（2）制備培養基①選擇培養基：以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養基：作為對照組，來判斷選擇培養基是否具有選擇作用思考：為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養基？葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】3.實驗步驟怎樣證明此培養基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養基牛肉膏蛋白胨培養基

是分離尿素細菌判斷該培養基有無選擇性實驗組對照組培養基類型是否接種

目的

結果只生長尿素細菌生長多種微生物是土壤中分解尿素的細菌的分離和計數①

測細菌數：一般用104、105、106稀釋液。②

測放線菌數：一般用103、104、105稀釋液。③

測真菌數：一般用102、103、104稀釋液。（3）樣品的稀釋與涂布平板

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300之間適于計數的平板。在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？

選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數?！就寥乐蟹纸饽蛩氐募毦姆蛛x與計數】3.實驗步驟測定土壤中細菌的總量和能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？為什么？因為土壤中能分解尿素的細菌的數量比細菌的總量要

。不相同少1）每個濃度設置了

個平板，1、2、3平板是選擇培養基（

實驗），4為

培養基（用以判斷選擇培養基是否具有選擇作用）；2）另外，整個實驗還要設置

個空白對照平板：未接種的

。培養基，以驗證培養基中是否含有雜菌。4重復牛肉膏蛋白胨2選擇培養基和牛肉膏蛋白胨【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】3.實驗步驟（3）樣品的稀釋與涂布平板組別具體組別具體操作作用實驗組實驗組1涂布接種的選擇培養基三次重復排除偶然因素對實驗結果的影響，用以分離并計數能分解尿素的細菌。實驗組2涂布接種的選擇培養基實驗組3涂布接種的選擇培養基實驗組4涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養基實驗組4與實驗組1、2、3組對比用以驗證選擇培養基是否具有選擇作用。對照組對照組1不涂布接種的選擇培養基對照組1與實驗組1、2、3組對比用以驗證選擇培養基中是否含有雜菌。對照組2不涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養基對照組2與實驗組4對比用以驗證牛肉膏蛋白胨培養基中是否含有雜菌。實驗結果實驗組1、2、3分離得到尿素分解菌的單菌落；第4組得到多種菌落；第5、6組正常情況下無菌落。本實驗實驗組和對照組設計如下：【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】①本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養皿時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。②建立“有菌觀念”。實驗室、實驗器材(取土樣的小鐵鏟、盛土樣的紙袋等)、操作者、空氣中都存在微生物，都有污染的可能，必須進行嚴格的消毒、滅菌，整個實驗過程(稱取土樣、稀釋土壤溶液等)要在酒精燈火焰旁進行。③本實驗耗時較長，需要事先規劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊?！就寥乐蟹纸饽蛩氐募毦姆蛛x與計數】3.實驗步驟（3）樣品的稀釋與涂布平板注意事項：①

培養條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養1～2d。②

觀察：每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。③

一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等?！就寥乐蟹纸饽蛩氐募毦姆蛛x與計數】3.實驗步驟（4）微生物的培養與觀察思考：得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎？不一定；因為有些微生物可以利用能分解尿素的細菌的代謝物進行生長繁殖。

（1）結合對照組，分析培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出一些菌落。

如果沒有接種的培養基上沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養基上的菌落數明顯多于選擇培養基上的菌落數，說明選擇培養基篩選出了一些尿素分解菌。4.結果分析與評價【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】

（2）你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近？

如果得到了兩個或多個菌落數為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。（3）你統計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數是多少？與其他同學統計的結果接近嗎？如果差異很大,可能是什么原因引起的？

如果是用同一土樣進行的操作，數據應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規范、培養基配制是否合理等方面查找原因。內容現象結論有無雜菌污染的判斷對照的培養皿中無菌落生長培養基中菌落數偏高菌落形態多樣，菌落數偏高選擇培養基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目大于選擇培養基上的數目樣品的稀釋操作得到3個或3個以上菌落數目在30~300的平板重復組的結果若選取同一土樣，統計結果應接近未被雜菌污染被雜菌污染培養基中混入其他雜菌選擇培養基具有篩選作用操作成功【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】4.結果分析與評價

本活動只是初步篩選了能分解尿素的細菌,對分離的菌種進行鑒定還需要借助生物化學的方法。你可以查閱相關資料,進一步設計實驗來鑒定自己分離的菌種。

細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會使培養基的堿性增強，pH升高，因此可以通過檢測培養基pH的變化來判斷是否發生了該化學反應，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。原理5.進一步探究脲酶的檢測CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2呈堿性，遇酚紅指示劑呈

紅

色。方法：在培養基中加入酚紅指示劑——鑒別培養基【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】酸堿指示劑酚酞變色反應區段：8.2-10.0，無色→紅色；酚紅變色反應區段：6.8-8.0，黃色→紅色；土壤中分解尿素的細菌的鑒定方法

在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。這樣，我們就可以初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。液體培養基：可以直接看液體的變色情況。固體培養基：【土壤中分解尿素的細菌的分離與計數】5.進一步探究在以尿素為唯一氮源的培養基中加入

，若菌落周圍出現

，則可說明該菌種能夠分解尿素。酚紅指示劑(更靈敏)紅色環帶紅色環帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越

。強土壤中分解尿素的細菌的鑒定項目選擇培養基鑒別培養基原理用途舉例圖示尿素分解菌大腸桿菌加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產物與培養基中的特定指示劑或化學藥品發生反應培養、分離出目標微生物鑒別目標微生物培養酵母菌和霉菌時，可在培養基中加入青霉素，抑制細菌的生長；利用以尿素為唯一氮源的培養基來培養可分解尿素的細菌可用伊紅美藍培養基鑒定飲用水或乳制品中是否含有大腸桿菌(若有，則菌落呈黑色)加入不影響甚至促進目標微生物生長，而抑制或阻止其他種類微生物生長的化學物質拓展延伸具體處理原理目的選擇培養基加入青霉素青霉素能抑制細菌生長，對真菌無作用不加氮源固氮微生物能利用空氣中的氮氣不加有機碳源自養型微生物能利用無機碳源鑒別培養基加入酚紅培養基尿素被分解產生氨，培養基呈堿性，酚紅指示劑變紅。加入剛果紅

剛果紅與纖維素能形成紅色復合物，當纖維素被分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以菌落為中心的透明圈。分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養微生物鑒別分解尿素的細菌鑒別纖維素分解菌發散思維實驗：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(1)測定不同微生物數量時，接種的土壤稀釋液的稀釋度相同()(2)利用稀釋涂布平板法統計菌落數目時，統計的菌落數就是活菌的實際數

()(3)菌落特征是鑒別菌種的重要依據()××√土壤中各種微生物的數量不同，因此分離不同的微生物要采用不同的稀釋度；當兩個或多個菌落連在一起時，只能觀察計為一個菌落，因此利用稀釋涂布平板法統計的菌落數目往往比活菌的實際數目少。課堂小結微生物的數量測定選擇培養基的作用微生物選擇培養獲取純培養物的方法-稀釋涂布平板法微生物的選擇培養和計數選擇培養基微生物的選擇培養科學實例篩選原則選擇培養基的概念及舉例稀釋涂布平板法的操作過程間接計數法—稀釋涂布平板法直接計數—計數板計數法土壤中分解尿素的細菌的分離與計數培養基的制備實驗設計（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋（3）稀釋涂布平板法接種（4）微生物的培養與觀察1.選擇培養基是指在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。2.稀釋涂布平板法不僅是分離和純化微生物的重要方法，也是測定微生物數量的重要方法。該方法通過統計平板上的菌落數來推測樣品中的活菌數，其原理是當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。3.平板劃線法可用于分離純化菌種，獲得單菌落，但不能進行微生物計數。4.一般來說，在一定的培養條件下(相同的培養基、溫度及培養時間)，同種微生物表現出穩定的菌落特征。這些特征包括菌落的形狀、大小和顏色等方面。5.土壤中分解尿素的細菌的分離與鑒定(1)尿素分解菌的篩選：以尿素為唯一氮源的選擇培養基可以篩選能分解尿素的細菌。(2)尿素分解菌的鑒別：在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，接種并培養初步篩選的菌種，若菌落周圍出現紅色環帶，則可說明該菌種能夠分解尿素。要語必背5.菌落是指分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體。采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養基上，之后經培養得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。6.平板劃線操作的第一步是灼燒接種環，目的是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。要語必背1.在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌的原因：_________________________________________________________________________________________________________________________________________。2.為了篩選能分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選