1．試管牛是有性生殖還是無性生殖？克隆動物呢？體外受精技術主要包括哪些步驟？2．什么是胚胎移植？可供移植的胚胎有哪些來源？該過程誰是供體？誰是受體？胚胎移植實際上是個什么過程？其實質是什么？進行胚胎移植有何優勢？3．什么是超數排卵？為何不直接注射性激素來達到目的？同期發情一般選用什么激素？4．什么是胚胎分割？胚胎分割技術屬于無性繁殖還是有性繁殖？什么樣的胚胎適合進行胚胎分割？囊胚階段的胚胎要進行分割要特別注意什么？胚胎移植前的性別鑒定，通常選擇什么部位的細胞？5．胚胎分割的成功率與分割次數有何關系？還存在哪些問題？溫故知新第3章基因工程第1節

重組DNA技術的基本工具

1.基因工程技術需要哪些工具？2.重組DNA技術的基本工具有哪些作用？本節聚焦：“螢火蟲”植物會發光，未來代替路燈從社會中來思考：1.科學家通過什么操作使植物發光？2.該方法是否可以使植物持續發光？3.植物的發光性狀是否可以遺傳給后代？科研人員通過納米粒子將熒光素酶直接注入到植物體內使植物發光，但這種方法只能使植物持續發光四小時，并且這種發光性狀是不能遺傳給后代的。從社會中來基因工程——是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。原理：優點：基因重組定向改造生物體的性狀1.基因工程的原理、操作水平、操作結果、場所？2.為什么不同生物DNA分子能夠連接起來？為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？3.重組DNA技術的三種工具？4.限制酶的來源、作用、結果？限制酶存在于原核生物中的作用？為什么不會切割自身的DNA？5.DAN連接酶的作用、分類？與DNA聚合酶的區別？6.質粒的本質？載體需要具備的條件？載體的分類、不同點？7.如何防止目的基因自身環化、目的基因反向拼接、質粒自身環化？8.DNA粗提取的原理？研磨的目的?低溫放置的目的？9.為什么不能選哺乳動物成熟的紅細胞？10.二苯胺試劑的使用條件？自主預習重組DNA技術的基本工具“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”如何利用相關工具獲得發出熒光的轉基因植物？1.以下為“螢火蟲”的DNA序列（僅展示一部分）。2.觀察該序列，思考選擇哪一種工具獲取熒光素酶基因？限制性內切核酸酶(限制酶)——“分子手術刀”3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’熒光素酶基因任務一：如何獲取熒光素酶基因呢？脫氧核糖A磷酸脫氧核糖G磷酸脫氧核糖T磷酸T磷酸脫氧核糖C磷酸脫氧核糖A磷酸脫氧核糖磷酸二酯鍵氫鍵知識回顧——DNA限制酶作用的是什么化學鍵？（一）限制酶的作用：ATCGTAGC5’3’5’3’1、識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列；2、使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”特點：具有特異性大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。（二）限制酶的來源：主要來自原核生物。限制酶能破壞外源DNA，如侵染細菌的噬菌體DNA，“限制”病毒在細菌內的寄生，而細菌自身DNA經過相應的化學修飾則不會被限制酶破壞。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”實例1——科學家在大腸桿菌中分離得到了一種限制酶，稱為EcoRⅠ

*EcoRⅠ識別序列為GAATTC

*EcoRⅠ可切割識別序列中軸線兩側的GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”（三）限制酶的作用結果：現學現用：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC結論：1.不同的限制酶切割形成的黏性末端一般不同；2.不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。當限制酶在它識別序列的中軸線處將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是平末端。SmaI平末端CGCCGGGCGCGC5'3'3'5'CGCCGGGCGCGC識別序列：

CCCGGG切割部位：

CG之間一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”

例1.下表為常用的限制性核酸內切酶及其識別序列和切割位點(注:表中Y為C或T,R為A或G)。據圖分析,可以得到的結論是(

)

A.限制酶的切割位點都在識別序列的中間B.限制酶切割后都形成黏性末端C.不同限制酶識別的序列不同所以切割后形成的末端也一定不同D.一種限制酶可能識別多種核苷酸序列

D即時練習利用限制酶獲取熒光素酶基因①SmaⅠ……C-C-C-G-G-G…………G-G-G-C-C-C……②EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……③TaqⅠ……T-C-G-A…………A-G-C-T……“想一想”：上圖DNA分子中有哪些限制酶的識別序列？“剪一剪”：能否選擇合適的限制酶獲取熒光素酶基因？3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’熒光素酶基因①SmaⅠ平末端②EcoRⅠ黏性末端:AATT(2)使用①SmaⅠ與②EcoRⅠ進行剪切3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’熒光素酶基因3’CCCCTTAAG...AGCT...CTTAA5’5’GGGGAATTC...TCGA...G3’熒光素酶基因(2)使用②EcoRⅠ進行剪切黏性末端:AATT

黏性末端:AATT②EcoRⅠ②EcoRⅠ3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’熒光素酶基因3’G...AGCT...CTTAA5’5’AATTC...TCGA...G3’熒光素酶基因會產生相同的黏性末端思考：如果把兩種來源不同的DNA用同種限制酶來切割，會產生怎樣的黏性末端？G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G

缺口怎么辦？連接兩個片段之間的磷酸二酯鍵GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（一）DNA連接酶的作用：二、DNA連接酶——“分子縫合針”（二）DNA連接酶的種類：E.coliDNA連接酶：（來自大腸桿菌）T4DNA連接酶：（來自T4噬菌體）平末端CGCCGGGCGCGC黏性末端GCTTAAAATTCGE.coliDNA連接酶連接平末端的效率要遠遠低于T4DNA連接酶二、DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵【資料1】真核細胞在自然狀態下往往難以接受外源DNA分子，即使吸收外源DNA也難以將其整合到自身的基因組上，還會將其降解。【資料2】1967年，科學家發現一種獨立于細菌擬核DNA之外且可以進行自我復制的環狀DNA分子——質粒，其可以在細菌之間轉移，是基因轉移的載體。在之后，科學家又相繼在真菌和一些植物細胞中發現了質粒。擬核質粒大腸桿菌三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”（一）載體的作用：將外源基因送入受體細胞,在受體細胞內對目的基因進行大量復制。二、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”(1)有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中(2)載體能穩定存在并能自我復制或整合到受體DNA上對受體細胞無害、易分離(3)有特殊標記基因，便于重組DNA分子的篩選

如：四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因。含有氨芐青霉素的選擇培養基篩選真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。（二）載體需具備的條件：（三）載體種類：質粒，噬菌體，動植物病毒1.標記基因的篩選原理

載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。如圖所示：2．如何提高篩選的準確性

當質粒上有兩個標記基因時，可將目的基因插入其中一個標記基因中，也就是重組質粒上只含一個標記基因，普通質粒上含有兩個標記基因。則沒有導入質粒的受體細胞不具有標記基因控制的性狀，導入普通質粒的受體細胞具有兩個標記基因控制的性狀，導入重組質粒的受體細胞只具有一個標記基因控制的性狀。這樣可根據標記基因控制的性狀準確篩選出含有重組質粒的受體細胞。小結基因工程的基本工具限制酶DNA連接酶載體來源：特點：作用部位：結果：磷酸二酯鍵主要來源于原核生物具有專一性形成黏性末端或平末端作為載體的條件種類:①穩定存在并能自我復制或整合到受體DNA上②有一個至多個限制酶切割位點；③對受體細胞無害、易分離；④有特殊的標記基因。質粒、噬菌體、動植物病毒連接部位：

磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′5′3′3′3′3′5′5′請利用兩張紙，按照P73頁“重組DNA分子”的要求完成操作。思考討論：…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATG

AATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAA

AATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′5′3′3′3′3′5′5′請利用兩張紙，按照P73頁“重組DNA分子”的要求完成操作。思考討論：1.質粒自身連接--自身環化2.目的基因(熒光素酶基因）自身環化3.兩個目的基因連在一起4.一個目的基因與一個質粒連接5.質粒與質粒連接出現連接的情況有：如何完成目的基因和載體的重組？探究?實踐DNA分子的粗提取和鑒定DNA不溶于酒精，但是細胞中的某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA和蛋白質。1.DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。2.在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，因此二苯胺試劑可作為鑒定DNA的試劑。DNA+二苯胺沸水浴藍色一、實驗原理0DNA溶解度NaCl濃度0.14mol/L2mol/L1、選材：DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。思考：能否選用牛、羊、馬、豬等哺乳動物的紅細胞做實驗材料？不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。二、材料用具2、試劑：試劑作用研磨液體積分數為95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺試劑析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現配現用溶解并提取DNA研磨加酒精析出溶解與鑒定提取上清液二、材料用具1、研磨稱取約30g洋蔥,切碎,然后放入研中,倒入10mL研磨液,充分研磨。2、提取上清液①在漏斗中墊上紗布,將洋蔥研磨液過濾到燒杯中,在4℃冰箱中放置幾分鐘后,再取上清液。②也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中,在1500r/min的轉速下離心5min,再取上清液放入燒杯中。使DNA分子從細胞核中釋放出來。不可以用濾紙，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。可能含有DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等。三、實驗步驟3、加酒精析出①在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%),靜置2-3min,溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分;②或者將溶液倒入塑料離心管中,在10000r/min的轉速下離心5min,棄上清液,將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。析出DNA避免破壞DNA。蛋白質溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。三、實驗步驟①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。4、溶解與鑒定將絲狀物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。實驗組對照組水浴加熱2mol/L的NaCl+二苯胺2mol/L的NaCl+絲狀物+二苯胺三、實驗步驟評價結果：（1）DNA純度：看提取物顏色（2）DNA的量：看與二苯胺反應顏色的深淺三、實驗步驟1.如果選用雞血細胞進行實驗，如何快速破碎細胞？2.有時會在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？3.有時會反復利用不同濃度的NaCl溶液來溶解、析出DNA，試猜想該操作的目的？將雞血細胞置于蒸餾水中，待細胞漲破后，收集濾液。利用蛋白酶分解雜質蛋白，不分解DNA，有利于D