第2節基因工程的基本操作程序第3章基因工程河北峰峰第二中學從社會中來

1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉基因抗蟲棉非轉基因抗蟲棉

蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲，將該細菌的“殺蟲基因”轉到棉花里，讓棉花也能產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。培育轉基因抗蟲棉主要需要四個步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。基因工程的基本操作程序獲：目的基因的篩選與獲取構：基因表達載體的構建導：將目的基因導入受體細胞檢：目的基因的檢測和鑒定（核心）一、目的基因的篩選與獲取

在基因工程的設計和操作中，用于_________________或_________________等的基因就是目的基因，根據不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_________________；1.目的基因概念：改變受體細胞性狀獲得預期表達產物編碼蛋白質的基因

與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解、工業用酶等相關的基因例如：2.篩選合適的目的基因：（1）方法：從相關的________和_________的基因中進行篩選已知結構功能清晰

隨著測序技術的發展，以及序列數據庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能（2）實例：Bt抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程蘇云金桿菌（Bt）制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害對Bt基因的表達產物-Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解：蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲蘇云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。相關信息：Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理：抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產生危害？

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響PCR是_______________的縮寫，是一項根據______________的原理，在____提供參與DNA復制的_______與_________，對____________________進行________的技術；3.利用PCR獲取和擴增目的基因（1）PCR的概念:聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外各種組分反應條件目的基因的核苷酸序列大量復制①全稱：②原理：③操作環境：④目的：⑤優點：聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制可以在短時間內大量擴增目的基因

PCR由穆里斯等人于1985年發明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎

如果說，沃森和克里克發現DNA雙螺旋結構，標志著分子生物學時代的開啟，那么PCR技術則標志著分子生物學的騰飛。PCR技術的出現，徹底變革了生物化學、分子生物學、遺傳學、以及現代醫學等等。（2）DNA復制所需的基本條件:參與的組分在DNA復制中的作用

解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）引物是一小段能與________的一段堿基序列________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物引物DNA模板耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸3’5’3’5’3’5’3’5’①變性

當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈②復性當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合③延伸當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈（3）PCR反應過程條件3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’緩沖溶液（含Mg2+)激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶第一輪循環的產物作為第二輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環的產物；第二輪循環的產物作為第三輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪的產物；第二輪循環的產物第三輪的產物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物

目的基因DNA________后________，____與單鏈相應互補序列結合；然后以_______為模板在__________作用下進行_____，即將4種__________加到__________，如此重復循環多次。過程歸納：受熱變性解為單鏈引物延伸單鏈DNADNA聚合酶引物的3’端脫氧核苷酸

由于延伸后得到的_____又可以作為下一個循環的_____，因而每一次循環后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式擴增（約為2n，其中n為擴增循環的次數）。產物模板一倍指數每次循環一般可以分為_____、_____、_____三步。變性復性延伸PCR過程演示用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。1.逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA

當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達二、基因表達載體的構建（核心）1.構建基因表達載體的目的：（1）讓目的基因在受體細胞中穩定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達和發揮作用。2.基因表達載體的構成終止子啟動子目的基因標記基因復制原點基因表達載體（1）啟動子：一段有特殊序列結構的____片段DNA①本質：②位置：位于基因的____，緊挨____________上游轉錄的起始位點③功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA誘導型啟動子：終止子啟動子目的基因標記基因復制原點基因表達載體（2）終止子：①本質：一段有特殊序列結構的____片段DNA②位置：位于基因的_____下游③功能：使轉錄在所需要的地方停下來（3）標記基因：①作用：便于重組DNA分子的篩選（4）目的基因：②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。如Bt基因。（5）復制原點：使能完成自主復制重組DNA分子限制酶3.基因表達載體的構建過程目的基因限制酶切割位點獲取目的基因連接酶基因表達載體構建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點質粒同種限制酶或能產生相同末端的限制酶？

在構建基因表達載體時，首先會用一定的________切割載體，使它出現一個_____；然后用_________或_______________________切割含有目的基因的DNA片段；再利用__________將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子。

基因表達載體的構建過程：限制酶切口同種限制酶能產生相同末端的限制酶DNA連接酶思考：（1）切割載體和切割含有目的基因的DNA片段為什么要用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶？產生相同的黏性末端或平末端，以便通過DNA連接酶連接；（2）用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，一定會形成符合要求的重組DNA分子嗎？不一定，載體和目的基因都可能出現自身環化或自身連接；目的基因也可能會出現反向連接（3）如何避免上述問題？

同時用兩種限制酶切割含目的基因的DNA片段和載體（使得目的基因的一端與載體一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端與載體另一端的黏性末端相同）將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？

這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因導入了受體細胞常用方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法三、將目的基因導入受體細胞（1）花粉管通道法：1.將目的基因導入植物細胞我國科學家獨創①用___________將___________________直接注入____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時間內，剪去____，將________滴加在________上，使目的基因借助___________進入_____；柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊受體細胞：受精卵

將目的基因插入_____________中，通過農桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________

目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程（2）農桿菌轉化法①轉化：②農桿菌特點：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對大多數___________沒有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農桿菌細胞內含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（___________）轉移到被侵染的細胞，并且將其_________________________；Ti質粒Ti質粒T-DNA可轉移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上③利用農桿菌進行轉化的思路：Ti質粒的T-DNA轉化進入植物細胞④農桿菌轉化法的過程：T-DNA目的基因構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌導入植物細胞表現出新性狀的植物植物細胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養⑤轉化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片_______________，然后_____________，并__________；受體細胞為_______與農桿菌共培養篩選轉化細胞再生成植株體細胞b.可以將____直接浸沒在________________中一段時間，然后培養植株并獲得____，再進行_____、_____等；受體細胞為_______花序含有農桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵2.將目的基因導入動物細胞——顯微注射法（1）受體細胞：受精卵。(因為受精卵容易表現出全能性)（2）過程：2025/4/9構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養胚胎移植獲得具有新性狀的動物3.將目的基因導入微生物細胞——Ca2+處理法（1）受體細胞：

常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛（2）原核生物的優點:

繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少、易于培養（3）一般過程:2025/4/9Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態將重組的基因表達載體導入其中Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性這種細胞稱為感受態細胞

檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性；四、目的基因的檢測與鑒定1.目的:2.檢測內容及方法:類型檢測內容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉錄出了mRNAPCR等技術目的基因是否翻譯成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體是否具有相應性狀病原體接種實驗等個體生物學水平的鑒定具體方法舉例轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常到社會中去1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現在經常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉基因棉花，或在轉基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學殺蟲劑的非轉基因棉花；在印度，一些地區要求，在轉基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉基因棉花。我國除新疆棉區及大型農場需設計專門的庇護所外，其他棉區如長江、黃河流域棉區多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構成天然的庇護所，一般無須種植非轉基因棉花作為庇護所。

這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環境，始終保持一定的敏感目標害蟲種群。這樣，即使目標害蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性，但是因為其與敏感目標害蟲交配，后代抗性基因會發生分離，所以抗性目標害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全生評價等。DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經歷___次循環；熱變性調節溫度自動調控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復制2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些________會向著________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構象二、材料用具①PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。三、方法步驟DNA片段的擴增1、移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分2、離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）3、反應：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min預變