1T/FDSAXXXX—202X生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測方法拉曼光譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于臨床分離株、尿液等樣本中抗生素耐藥菌的快速測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理樣品經(jīng)過濾除去大分子、細菌培養(yǎng)、抗生素作用等方法，加表面增強試劑對待測液中的目標(biāo)分子拉曼信號進行增強。用拉曼光譜儀采集樣品的拉曼光譜信號進行分析，以重水標(biāo)記特有的拉曼特征峰（2180cm-1）作為定性基準(zhǔn)峰，建立方法數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)待測樣本中目標(biāo)物的快速檢測。5試劑和材料5.1試劑除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1二甲基亞砜。5.1.2甲醇。5.1.30.1mol/L鹽酸。5.1.4磷酸鹽緩沖液。5.1.5重水（D2O）。5.1.6慶大霉素。5.1.7營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取8g營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，溶解于200mL蒸餾水中，121℃高壓5.1.8MH培養(yǎng)基：稱取4.2gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶解于200mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌2T/FDSAXXXX—202X5.2材料5.2.1塑料具塞離心管：2mL和10mL。5.2.2移液吸頭：200μL，1000μL和5000μL。6儀器設(shè)備6.1流式拉曼光譜儀6.2穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長為532±1nm，線寬＜0.1nm，能量≥250mW；光譜分辨率≤10cm-1；光譜響應(yīng)范圍300cm-1~2700cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。6.3移液器：0.1-2.5μL、2-20μL、10-100μL和100-1000μL。6.4渦旋振蕩器。6.5離心機：轉(zhuǎn)速≥10000轉(zhuǎn)/min。6.6電子天平：感量為0.01g和0.0001g。6.7塑料具塞離心管：2mL和50mL6.8移液吸頭：10μL，200μL和1000μL。6.9麥?zhǔn)蠞岫葍x。6.10孵育箱。7分析步驟7.1取樣制樣臨床分離株：將平板上的單菌落挑取至含有MH培養(yǎng)基的玻璃管中，混勻；麥?zhǔn)蠞岫葍x檢測為0.5，對照濁度表將菌懸液稀釋至5×105CFU/mL；尿液樣品：取樣品用5μm過濾器對尿液樣本進行過濾取出大分子雜質(zhì)，麥?zhǔn)蠞岫葍x檢測菌懸液濁度，對照濁度表將菌懸液稀釋至5×105CFU/mL；7.2抗生素作用將倍比稀釋的各濃度梯度的抗生素分別與菌懸液混合。如慶大霉素，用一級水配制母液濃度為50mg/mL備用，將母液稀釋至960μg/mL后，采用倍比稀釋法在安全柜中完成各濃度梯度的抗生素配制，后續(xù)分別取20μL不同濃度慶大霉素加入到580μL菌懸液中，獲得含有0.5-32μg/mL的菌懸液，混勻，37oC孵育1小時。7.3重水標(biāo)記將重水使用0.22μm無機或有機濾膜配合注射器過濾滅菌，取一定量重水加入到孵育1小時的菌懸液中，混勻，重水終濃度為40%，37oC孵育2小時。7.4離心清洗孵育完成后，混合體系完全取出，將液體移至離心管中6500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，水洗3T/FDSAXXXX—202X三次，等體積水重懸。7.5測定7.5.1拉曼光譜儀器分析參考條件50×倍鏡下激光能量≥9.47mW，數(shù)據(jù)采集時間≥6s。7.5.2測定取3μL離心重懸后樣本滴加在鋁片上，干燥后進行拉曼檢測。7.6質(zhì)控試驗每批樣品應(yīng)同時進行陰性對照和陽性對照試驗。7.6.1陰性對照稱取空白試樣，按照7.1-7.5步驟與樣品同法操作。7.6.2陽性對照制備菌懸液，將加入抗生素換成等體積水，按照7.1-7.5步驟與樣品同法操作。8結(jié)果計算和表達8.1定性儀器軟件將測試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫中的對應(yīng)樣本譜圖進行匹配計算，根據(jù)測試譜圖與軟件內(nèi)置譜圖進行特征峰比對計算，進而判定待測樣本中是否含有目標(biāo)物特征峰，如待測樣本待測樣本含有目標(biāo)物特征峰，并且特征峰與空白樣本存在顯著性差異，儀器將顯示陽性或檢出，如待測樣本不含有目標(biāo)物特征峰或與空白樣本無顯著性差異，儀器將顯示陰性或未檢出。重水的表面增強拉曼光譜圖參附錄A.1。8.2確證本方法為初篩方法，當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)用其他技術(shù)手段進行確證。9方法性能指標(biāo)9.1檢出限本方法檢出限為40%重水當(dāng)量。9.2靈敏度靈敏度應(yīng)≥95%。9.3特異性特異性應(yīng)≥95%。9.4假陰性率假陰性率應(yīng)≤5%。4T/FDSAXXXX—202X9.5假陽性率假陽性率應(yīng)≤5%。性能指標(biāo)計算方法見附錄B中表B.1。5T/FDSAXXXX—202X含重水質(zhì)控樣本的拉曼光譜圖圖A.1含重水質(zhì)控樣本的拉曼光譜圖法6T/FDSAXXXX—202X快速檢測方法性能計算表快速檢測方法性能指標(biāo)計算表見表B.1。表B.1性能指標(biāo)計算方法樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)N11N12N1.=N11+N12N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2)x2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標(biāo)指行，第二個下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有