分子生物學常用檢測技術DNA—四種核苷酸(A-T-C-G)組成得多聚骨架所有組成DNA得核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三種成分組成:1)一個2’-脫氧核糖(戊糖)2)一個含氮堿基嘌呤:A\G嘧啶:T/C3)三個磷酸基團各單個核苷酸由5’和3’-碳形成得磷酸二酯鍵連接在一起變性、復性、退火和淬火基因分子生物學常用技術

PCR(聚合酶鏈式反應)核酸分子雜交基因芯片技術(biochip)DNA測序(DNAsequencing)DNA重組技術(DNArebination)

一、聚合酶鏈反應

(PolymeraseChainReaction,PCR)體外基因擴增技術

特異性強靈敏度高操作簡單、省時對待檢原始材料質量要求低高效率得基因擴增技術(一)PCR原理原理雙鏈DNA變性退火鏈延伸

(膜板)

(雙鏈分成單鏈)(膜板與引物雜交)(DNA合成)不斷重復PCR反應體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA聚合酶模板引物

和或和(二)PCR反應得設計及影響因素9大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流PCR得種類熒光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'熒光定量PCR定量PCR得數學原理PCR理論方程N=N0x(1+E)nN:擴增數量N0:起始模板數量E:擴增效率N:循環數Log[DNA]循環數線性增長期Linear平臺期Plateauy=N0(1+e)n指數增長期Geometric定量PCR得數學原理Rn(熒光強度)循環數CycleNumber指數增長期平臺期CT=-klogN0+bCt

(Cyclethreshold)值:就是指每個反應管內得熒光信號到達設定域值(threshold)時所經歷得循環數。PCR得臨床應用對病原微生物核酸進行快速檢測彌補免疫檢測得缺陷縮短診斷得窗口期(如HBV,HIV)用于藥物療效監測和評估用于腫瘤基因表達方面得研究用于遺傳病得診斷項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其她體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1、鼻咽拭子或體液標本。2、也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1、尿液:中段晨尿20ml于加蓋試管。其她體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1、痰液:患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2、其她組織標本:留于無菌試管。3、也可取抗凝血標本,但一般不推薦。MP呼吸道病毒

咽拭子樣本采集要求項目標本采集所需容器CT男性:尿道分泌物:細小棉拭子伸入尿道約2～4厘米,旋轉數圈取出分泌物(應略帶粘膜)。前列腺液、精液。女性:陰道分泌物:用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物,再用無菌棉拭子插入宮頸內,停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物:同上一次性無菌帶蓋得試管。NGUUTPHPVHSV二、核酸分子雜交根據核酸變性和復性得原理,不同來源得變性單鏈核酸分子在合適得條件下,通過堿基互補形成雙鏈雜交體得過程稱為核酸分子雜交(molecularhybridization)。1、遺傳病得診斷2、病原體得鑒定3、癌基因突變得檢測4、組織配型5、親子鑒定核酸分子雜交得臨床應用三、基因芯片技術基質材料分,有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等。

用點樣法固定在玻璃板上得DNA探針陣列原位合成法在玻璃等硬質表面上直接合成得寡核苷酸探針陣列基因芯片技術得應用1、藥物篩選和新藥開發2、疾病診斷3、環境保護4、司法5、現代農業四、測序技術CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT(一)一代測序技術(二)二代測序技術Illumina公司得Solexa和Hiseq應該說就是目前全球使用量最大得第二代測序機器,這兩個系列得技術核心原理就是相同得。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序得基本原理就是邊合成邊測序。在Sanger