PAGEPAGE13魚類生理學實驗指導動物科學與營養(yǎng)工程學院2013年10月實驗一、坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本制備目的學習生理學實驗基本的組織分離技術(shù)；學習和掌握制備蛙類坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本的方法；了解刺激的種類。原理蛙類的一些基本生命活動和生理功能與恒溫動物相似，若將蛙的神經(jīng)-肌肉標本放在任氏液中，其興奮性在幾個小時內(nèi)可保持不變。若給神經(jīng)或肌肉一次適宜刺激，可在神經(jīng)和肌肉上產(chǎn)生一個動作電位，肉眼可看到肌肉收縮和舒張一次，表明神經(jīng)和肌肉產(chǎn)生了一次興奮。在生理學實驗中常利用蛙的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本研究神經(jīng)、肌肉的興奮、興奮性；刺激與反應的規(guī)律和肌肉收縮的特征等，制備坐骨神經(jīng)腓腸肌標本是生理學實驗的一項基本操作技術(shù)。

實驗動物與用品蟾蜍或蛙、任氏液、食鹽、1%H2SO4濾紙、普通剪刀、手術(shù)剪、眼科鑷（或尖頭無齒鑷）、金屬探針（解剖針）、玻璃分針、蛙板（或玻璃板）、蛙釘、細線、培養(yǎng)皿、滴管、鋅銅弓（或電子刺激器）、酒精燈。實驗步驟與項目破壞腦、脊髓

取蟾蜍一只，用自來水沖洗干凈（勿用手搓）。左手握住蟾蜍，使其背部向上，用大拇指或食指使頭前俯(以頭顱后緣稍稍拱起為宜)。右手持探針由頭顱后緣的枕骨大孔處垂直刺入椎管（圖）。然后將探針改向前刺入顱腔內(nèi)，左右攪動探針2～3次，搗毀腦組織。如果探針在顱腔內(nèi)，應有碰及顱底骨的感覺。再將探針退回至枕骨大孔，使針尖轉(zhuǎn)向尾端，捻動探針使其刺入椎管，搗毀脊髓。此時應注意將脊柱保持平直。針進入椎管的感覺是，進針時有一定的阻力，而且隨著進針蟾蜍出現(xiàn)下肢僵直或尿失禁現(xiàn)象。若腦和脊髓破壞完全，蟾蜍下頜呼吸運動消失,四肢完全松軟，失去一切反射活動。此時可將探針反向捻動，退出椎管。如蟾蜍仍有反射活動，表示腦和脊髓破壞不徹底，應重新破壞。

2.剪除軀干上部、皮膚及內(nèi)臟

用左手捏住蟾蜍的脊柱，右手持粗剪刀在前肢腋窩處連同皮膚、腹肌、脊柱一并剪斷，然后左手握住蟾蜍的后肢，緊靠脊柱兩側(cè)將腹壁及內(nèi)臟剪去(注意避開坐骨神經(jīng)),并剪去肛門周圍的皮膚，留下脊柱和后肢。3.剝皮

一只手捏住脊柱的斷端（注意不要捏住脊柱兩側(cè)的神經(jīng)），另一只手捏住其皮膚的邊緣,向下剝?nèi)ト亢笾钠つw（圖5.1-2）。將標本放在干凈的任氏液中。將手及使用過的探針、剪刀全部沖洗干凈。

4.分離兩腿

用鑷子取出標本,左手捏住脊柱斷端,使標本背面朝上，右手用粗剪刀剪去突出的骶骨（也可不進行此步）。然后將脊柱腹側(cè)向上，左手的兩個手指捏住脊柱斷端的橫突，另一手指將兩后肢擔起，形成一個平面。此時用粗剪刀沿正中線將脊柱盆骨分為兩半(注意，勿傷坐骨神經(jīng))。將一半后肢標本置于盛有任氏液中備用,另一半放在蛙板上進行下列操作。5.辯認蛙后肢的主要肌肉，蛙類的坐骨神經(jīng)是由第7、8、9對脊神經(jīng)從相對應的椎間孔穿出匯合而成，行走于脊柱的兩側(cè)，到尾端（肛門處）繞過坐骨聯(lián)合，到達后肢背側(cè)，行走于梨狀肌下的股二頭肌和半膜肌之間的坐骨神經(jīng)溝內(nèi)，到達膝關(guān)節(jié)腘窩處有分支進入腓腸肌（圖5.1-3）。

6.游離坐骨神經(jīng)和腓腸肌

用蛙釘或左手的兩個手指將標本繃直、固定。先在腹腔面用玻璃分針沿脊柱游離坐骨神經(jīng),然后在標本的背側(cè)于股二頭肌與半膜肌的肌肉縫內(nèi)將坐骨神經(jīng)與周邊的結(jié)締組織分離直到腘窩，但不要傷及神經(jīng)，其分支待以后用手術(shù)剪剪斷。同樣用玻璃分針將腓腸肌與其下的結(jié)締組織分離并在其跟腱處穿線、結(jié)扎。7.剪去其它不用的組織

操作從脊柱向小腿方向進行。（1）剪去多余的脊柱和肌肉

將后肢標本腹面向上，將坐骨神經(jīng)連同2～3節(jié)脊椎用粗剪刀從脊柱上剪下來。再將標本背面向上，用鑷子輕輕提起脊椎，自上而下剪去支配腓腸肌以外的神經(jīng)分支，直至腘窩（圖5.1-4(A)），并搭放在腓腸肌上。沿膝關(guān)節(jié)剪去股骨周圍的肌肉，并將股骨刮凈，用粗剪刀剪去股骨上端的1/3（保留2/3），制成坐骨神經(jīng)-小腿的標本。（2）完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標本

將脊椎和坐骨神經(jīng)從腓腸肌上取下，提起腓腸肌的結(jié)扎線剪斷跟腱。用粗剪剪去膝關(guān)節(jié)以下部位，便制成了坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本（圖5.1-4(B)）。8.檢驗標本

用鑷子夾持坐骨神經(jīng)中樞端,如腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮，說明標本的興奮性良好。標本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中備用。然后再依次用熱玻棒、食鹽（或1%H2SO4濾紙）刺激坐骨神經(jīng)中樞端（或肌肉），觀察肌肉收縮有何變化?如果放上食鹽肌肉無動靜,用任氏液將鹽沖洗掉,再觀察沖洗過程中肌肉收縮有何變化?

注意事項避免蟾蜍體表毒液和血液污染標本，壓擠、損傷和用力牽拉標本，不可用金屬器械觸碰神經(jīng)干。在操作過程中，應給神經(jīng)和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影響標本的興奮性。標本制成后須放在任氏液中浸泡數(shù)分鐘,使標本興奮性穩(wěn)定,再開始實驗效果會較好。熱玻棒的溫度防止過高,以免燙傷標本。思考題用各種刺激檢驗標本興奮性時，為什么要從中樞端開始？刺激有幾種形式?如何解釋對食鹽的不同處理對肌肉收縮的影響?實驗二、反射弧的分析目的分析反射弧的組成并證明反射活動的完成有賴于反射弧的完整存在。原理反射活動是依靠反射弧實現(xiàn)的。反射弧包括感受器、傳入神經(jīng)、神經(jīng)中樞、傳出神經(jīng)和效應器五部分。反射弧的結(jié)構(gòu)和功能的完整是實現(xiàn)反射活動的必要條件。反射弧的任何一部分受到破壞，反射活動將不能實現(xiàn)。反射弧示意圖實驗動物與用品蛙（或蟾蜍），蛙類手術(shù)器械，支架，玻棒，燒杯，玻璃皿，紗布，線，濾紙，棉花，0.5%、1%硫酸，1%可卡因。實驗步驟與項目取一只蛙，破壞大腦，但保留脊髓，即做成脊蛙標本。然后用肌夾夾住蛙的下頜（或用大頭針鉤住下頜），并將脊蛙懸掛在支架上。待其安靜后進行下列實驗項目。用燒杯盛0.5%硫酸，分別刺激蛙兩后肢趾端，觀察有無反應？為什么？待出現(xiàn)反應后，立即用清水洗凈腳趾，并用紗布擦干。2、在蛙左后肢踝關(guān)節(jié)上方，將皮膚作一環(huán)形切口，剝?nèi)∏锌谝韵缕つw（注意除凈趾尖皮膚），再用0.5%硫酸刺激該肢趾端，有無反應？為什么？3、剪開右側(cè)大腿背側(cè)的皮膚，再股二頭肌和半膜肌之間分離出坐骨神經(jīng)干，在坐骨神經(jīng)干放一浸過1%可卡因的小棉球，然后每隔數(shù)秒鐘用0.5%的硫酸刺激該后肢腳趾，直到不引起反應為止，為什么？4、當右后肢不再出現(xiàn)收縮反應時，立即將浸過1%硫酸的濾紙片貼在該后肢軀干部皮膚上，該后肢是否仍然出現(xiàn)反應？為什么？每隔數(shù)秒同樣刺激一次，直到不能引起右后肢反應為止。為什么？5、用蛙針破壞脊髓，再刺激蛙身體的任何部位，有無反應？為什么？注意事項?毀腦時不可傷及脊髓，以免破壞脊髓反射中樞。?分離坐骨神經(jīng)應盡量向上，并盡量剪斷與其相連的分支。?每次酸刺激后應立即用清水洗凈腳趾，并用紗布揩干。?剝脫腳趾皮膚要完全，若剩留少量皮膚會影響實驗結(jié)果。注坐骨神經(jīng)干中包括傳入神經(jīng)纖維和傳出神經(jīng)纖維。由于傳出神經(jīng)纖維較粗，故其麻醉所需時間較傳出神經(jīng)纖維為長。實驗三、凝血時間的測定目的學習凝血時間的測定方法。原理血液流出血管后，受到刺激的血小板就會釋放出一系列凝血因子，使血中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成網(wǎng)狀的纖維蛋白，血液發(fā)生凝固。測定凝血時間可反映血液本身出凝血因子是否缺乏或減少。本實驗用魚作為實驗材料比常規(guī)的家兔和鼠所用儀器要少，費用低，實驗控制更易。實驗動物與用品150

g重的鯉魚，注射器，玻片，尖針，秒表。實驗步驟與項目

取血方法：將魚用濕布包住，側(cè)臥于木板上，在魚尾部（腹鰭和尾鰭之間）側(cè)線下方用手去除少許鱗片，將注射器在側(cè)線下方1～2

mm處垂直插入肌肉，碰到脊椎骨后，稍往下方移動，插入尾靜脈內(nèi)，輕輕抽取注射器，讓血在負壓作用自然流入注射器內(nèi)。2、凝血時間觀察：將注射器內(nèi)的血小心注在事先準血好的玻片上，記下時間，每隔30

s用針尖挑血一次，直至挑起細纖維血絲為止。從開始出血到挑出細纖維血絲的時間即為凝血時間。注意事項

濕布包魚時僅將身體部位包住，不要包到鰓，以免影響魚呼吸；如一時抽不出血可輕輕轉(zhuǎn)動注射器，直至血被抽出為止；針尖挑血應向一個方向直挑，不可多個方向挑動或挑動次數(shù)過多，以免造成破壞纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成不凝血的假象。

實驗結(jié)果報告該實驗動物的凝血時間。并對全班的結(jié)果加以統(tǒng)計，用平均值±標準差表示。討論血液凝固對機體的生理意義。

實驗四、影響血液凝固的因素目的以血液凝固時間作為指標，了解對血液凝固影響的因素，加深對生理止血過程的理解。原理

血液凝固是一個酶的有限水解激活過程，在此過程中有多種凝血因子參與。根據(jù)凝血過程起動時激活因子來源不同，可將血液凝固分為內(nèi)源性激活途徑和外源性激活途徑。內(nèi)源性激活途徑是指參與血液凝固的所有凝血因子在血漿中，外源性激活途徑是指受損的組織中的組織因子進入血管后，與血管內(nèi)的凝血因子共同作用而啟動的激活過程。實驗動物與用品雞、2%草酸鉀溶液、EDTA-Na，生理鹽水，液狀石蠟、注射器，試管6支、小燒杯2個、試管架,竹簽1束(或細試管刷)實驗步驟與項目

取血方法：將雞保定，側(cè)臥于木板上，打開翅膀，找到翼靜脈，酒精棉球消毒，從靜脈的下部傾斜進針，插入靜脈內(nèi)，回血后，輕輕抽取注射器，讓血在負壓作用自然流入注射器內(nèi)。2、試管準備好試管1

不加任何處理（對照管）試管2

用液狀石蠟潤滑整個試管內(nèi)表面試管3

放少許棉花試管4

置于有冰塊的小燒杯中試管5

EDTA1滴試管6

加草酸鉀1～2

ml每管加入血液2

ml。將多余的血盛于小燒杯中，并不斷用竹簽攪動直至纖維蛋白形成。記錄凝血時間

每個試管加血2

ml后，即刻開始計時，每隔壁15

s

傾斜一次，觀察血液是否凝固，至血液成為凝膠狀不再流動為止，記錄所經(jīng)歷的時間。5、6、7號試管加入血液后，用拇指蓋住試管口將試管顛倒兩次，使血液與藥物混合。5.如果加EDTA和草酸鉀的試管不出現(xiàn)血凝,可再向兩管內(nèi)分別加入0.025

mol?L-1的CaCl2溶容液2～3滴,觀察血液是否發(fā)生凝固?注意事項采血的過程盡量要快，以減少計時的誤差。對比實驗的采血時間要緊接著進行。判斷凝血的標準要力求一致。一般以傾斜試管達45o時，試管內(nèi)血液不見流動為準。每支試管口徑大小及采血量要相對一致，不可相差太大。實驗結(jié)果將實驗結(jié)果及各種條件下的凝血時間按表填寫,并進行比較、分析解釋產(chǎn)生差異的原因。實驗管號實驗處理凝血時間1不加任何處理2用液體石蠟潤滑試管內(nèi)表面3放少許棉花4置于有冰塊的燒杯中5加草酸鉀1ml～2mL6EDTA1滴實驗五、胃腸運動的直接觀察目的觀察動物在麻醉情況下的胃腸活動及其影響因素，原理胃腸平滑肌具有自動節(jié)律性活動。胃的運動有蠕動和緊張性收縮；腸的運動有蠕動、分節(jié)運動和擺動等。在正常機體內(nèi)，胃腸運動受神經(jīng)的體液因素的調(diào)節(jié)。實驗動物與用品喂飽的兔，手術(shù)臺，麻醉藥，常用手術(shù)器械，電刺激器，臺氏液，臉盆。0.01%乙酰膽堿，0.1%腎上腺素，0.1%阿托品。實驗步驟與項目1、將兔麻醉仰臥固定于手術(shù)臺上，剪去頸部及腹部背毛。切開頸部皮膚，分離一側(cè)迷走神經(jīng)，于其下穿一線備用。剖開腹腔，在腎上腺附近找出左側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)，亦于其下穿一線備用。將兔體浸入盛有37℃2、觀察正常胃腸運動的形式和頻率。3、以中等強度的感應電流刺激一側(cè)迷走神經(jīng)離中端，胃腸運動有何變化？為什么？4、刺激內(nèi)臟大神經(jīng)，胃腸運動有何變化？切斷內(nèi)臟大神經(jīng)，胃腸運動又有何變化？為什么？5、用鑷子夾小腸任何一處，觀察有何現(xiàn)象發(fā)生？為什么？6、在小腸上直接滴加0.01%乙酰膽堿數(shù)滴，胃腸運動有何變化？沖去藥物作用后，再滴加0.1%腎上腺素數(shù)滴，胃腸運動又有何變化？為什么？思考題胃腸運動有哪些形式？并說明其生理作用。實驗六、滲透壓對小腸吸收的影響目的了解小腸吸收與腸內(nèi)容物滲透壓之間的關(guān)系。原理小腸是消化產(chǎn)物吸收的主要部位。腸內(nèi)容物滲透壓的大小是制約小腸吸收的因素，在一定范圍內(nèi)，腸內(nèi)容物濃度愈大，吸收愈慢；濃度過高時，則出現(xiàn)反滲透現(xiàn)象。實驗動物與用品兔，手術(shù)臺，麻醉藥，常用手術(shù)器械，絲線，10mL注射器，3%、0.9%和0.3%NaCL溶液。實驗步驟與方法將兔麻醉仰臥固定，剖開腹腔，拉出空腸約18cm，輕輕地移去其中的內(nèi)容物，再用絲線結(jié)扎為等長的A、B、C三段。在A腸段中注入3%NaCL溶液5mL；在B腸段中注入0.9%NaCL溶液5mL；在C腸段中注入0.3%NaCL溶液5mL。然后將各腸段全部放回腹腔中，經(jīng)30分鐘以上，觀察A、B、C三段腸段內(nèi)溶液被吸收的程度有何不同，為什么？實驗七、影響尿生成的若干因素目的了解對尿生成的若干影響因素。原理尿的生成過程包括腎小球的濾過，腎小管與集合管的重吸收和分泌。凡對這些過程有影響的因素都可影響尿的生成。實驗動物與用品兔，手術(shù)臺，常用手術(shù)器械，電刺激器，塑料管，膀胱套管，20%葡萄糖，10%Na2SO4或12%尿素，生理鹽水，0.1%腎上腺素，垂體后葉素，5%阿拉伯膠。實驗步驟與項目實驗前給兔足夠飲水或喂以多汁飼料。實驗時，將兔麻醉仰臥保定在手術(shù)臺上。在下腹部靠近恥骨聯(lián)合前緣，沿腹部正中線切開腹壁，暴露膀胱，輕輕將拉出腹腔。在膀胱底部找出一側(cè)輸尿管，在輸尿管的下面穿一細線備用。在輸尿管上剪一小口，由小口朝腎臟方向插入一根充滿生理鹽水的塑料管，一備用線結(jié)扎固定。塑料管的另一端對準記滴器的受滴器，以便記滴?；蛘咴诎螂赘姑嬲邢茸骱砂p合，在縫合圈的中心剪一小口，插入膀胱套管，然后收緊縫線，固定膀胱套管，在套管的另一端連接塑料管，另外，由頸部找出右側(cè)迷走神經(jīng)，并穿線備用，進行下列實驗項目。計數(shù)5-10分鐘內(nèi)尿的正常分泌滴數(shù)。靜注20%葡萄糖5mL，尿量有何變化？為什么？待尿分泌恢復正常后，再進行下項實驗（以下同）。剪斷右側(cè)迷走神經(jīng)，以中等強度的電流刺