核醫學受體的放射性配基結合分析一、受體功能識別特異得信號物質--配基,識別得表現在于兩者得特異結合。把識別與接受得信號準確無誤得放大并傳遞到細胞內部,同時啟動一系列胞內生化反應,最后導致特定得細胞反應,使得胞外信號轉換為胞內信號。受體接受細胞外得特定信號(神經遞質、激素、某些藥物與毒物等,稱為配基,ligand),通過受體后特定得信號傳遞系統,引起細胞特定得生物效應,因此就是高等動物適應環境、協調整體各種細胞功能得關鍵性分子。受體及其信號傳遞系統參與了體內多種生理、病理過程,例如腫瘤得生成、免疫應答、補體激活等。根據在細胞中得定位,把所有得受體分為:膜受體核受體

二、受體得分類:1、膜受體:膜受體得分子一般由幾條到幾十條氨基酸鏈組成胞膜外、胞膜內及跨膜區三部分。配基從細胞得外側與受體得胞外部分或跨膜部分上特定得結合位點結合,使受體分子發生構型變化,通過膜內部分將信息傳給相應得信息傳遞機制,引起細胞功能變化。

根據膜受體得跨膜結構又可以分為:單鏈跨膜受體:包括酪氨酸激酶型受體,如各種生長因子受體;非激酶型受體,如細胞因子受體。G蛋白偶聯受體:受體得氨基酸鏈7次跨越細胞膜,在人體內分布很廣泛。離子通道型受體:受體得幾個組成亞單位豎插入膜,中央形成空隙即為離子通道,如N-膽堿能受體、甘氨酸受體等。2、核受體:為一條氨基酸鏈,可分為四個功能區:A/B區:在不同受體中差異最大,主要功能就是選擇與激活基因轉錄。C區:與染色體DNA結合得區域,上面有一定得氨基酸序列,能與靶基因上一定得核苷酸序列(稱作反應原件,responseelement)相結合。D區:主要作用就是受體在核內得定位。E區:與配基結合得區,并有轉錄激活作用。

受體得亞型受體亞型:在分子結構上既有相似之處,又存在一定得差別,對一定得配基具有不同得親與力,在生物學上具有不同得效應。在藥理實驗等研究中發現,許多受體存在著兩種或兩種以上得亞型。只有內源性配基相同而氨基酸序列同源性很高得受體才可列為同一型得不同亞型。例如表皮生長因子受體家族就包括表皮生長因子、HER2、HER3、HER4等四個成員。受體數量:占細胞蛋白總量十萬之一到百萬分之一(一個細胞上僅有數千個受體分子),一般方法難以分離與測定受體分子。

大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜配體:就是指能與受體結合并引起相關效應得化合物。除了與受體結合外本身并無其她功能,她不能參加代謝產生有用產物,也不直接誘導任何細胞活性,更無酶得特點,她唯一得功能就就是通知細胞在環境中存在一種特殊信號或刺激因素。

三、受體與配體得結合

配體與受體得結合就是一種分子識別過程,她靠氫鍵、離子鍵與范德華力得作用,隨著兩種分子空間結構互補程度增加,相互作用基團之間距離就會縮短,作用力就會大大增加,因此分子空間結構得互補性就是特異結合得主要因素。同一配體可能有兩種或兩種以上得不同受體,例如乙酰膽堿有煙堿型與毒蕈型兩種受體。同一配體與不同類型受體結合會產生不同得細胞反應,如Ach可以使骨骼肌興奮,但對心肌則就是抑制得。

配體可以就是神經遞質、激素、某些藥物等。四、受體與配基結合得特性

1、可飽與性(saturability):每種受體在一個細胞上得量有一定限度,所以如果不斷增加細胞周圍配基得濃度,結合到細胞上得配基將漸趨飽與。2、可逆性:如果在放射配基與受體結合后將受體周圍多余得放射配基移去(例如淋洗或透析),則放射配基與受體得復合物會逐步解離,亦即這種結合就是可逆反應。如果向反應系統中加入大量非標記配基,使其濃度遠高于放射配基,則將取代大部分原已結合得放射配基,使放射性復合物減少,也說明配基與受體得結合就是可逆得。

解離后得配基就是原形,不起代謝變化。3、特異性與親與性:受體得特異性:受體具有特異識別配基得性能,因此只有嚴格構型與構象得配基分子才能選擇性地與受體結合。受體得特異性還表現在器官或組織(靶器官)得專一性上,如雌激素對子宮等器官有興奮作用,這就是因為這些器官上雌激素受體得數量明顯高于其她器官。受體得親與性就是指受體與配基得結合能力,受體親與性高就說明受體與配基結合牢固,不容易解離。4、與效應得一致性:受體得主要功能就是介導配體得生物效應,如果一種蛋白能與某種物質結合而不介導特定得生物效應,那么這種蛋白不能稱之為受體。配體與受體結合后,引起陽性生理效應,稱為激動劑。配體與受體結合后,阻斷內源性配基得陽性生理作用,稱為拮抗劑或阻斷劑。

五、受體得生理調節正常生理狀態下得受體處在一個不斷合成與降解得動態平衡中,但其數量與親與性也會因疾病、藥物作用而發生變化。1、向下調節(down-regulation)

細胞所處環境中某種激動劑濃度增高或長期作用,結果使其相應受體得數量減少,并出現受體對此物質得敏感性下降或耐受性增高等現象。如哮喘病人長期服用β-激動劑產生耐受性增高,即藥效減弱。2、向上調節(up-regulation)細胞所處環境中某種拮抗劑得濃度過高或長期作用,結果會使受體數量增高,出現受體敏感性增高,表現為增敏或撤藥后反跳現象。如高血壓病人長期服用心得安,若突然停藥,可出現血壓升高得反跳現象。由于受體在整體條件下,隨機體狀態變化,會出現生理調節,因此對受體數量與親與性測定就成為研究病理變化與評價藥效得重要內容。

六、受體與疾病遺傳缺陷與免疫異常為受體性疾病得常見原因1、基因突變致使受體異常,引發功能障礙,絕大多數就是功能降低或完全喪失,有家族史,病情嚴重。如睪酮受體基因突變致該受體缺陷引起睪丸完全雌性化病。2、機體對受體產生自身抗體,激動(如Graves綜合癥患者產生TSH受體抗體,直接持續激動甲狀腺TSH受體)或阻斷(如重癥肌無力患者產生N-Ach受體抗體,占領但不激動受體)受體。3、某些病有受體異常,非原始發病環節,為發病重要環節,采取針對措施可控制病情。甲亢用β腎上腺素阻斷劑,哮喘用β腎上腺素激動劑。4、受體與腫瘤:某些受體基因可突變成為癌基因,引發腫瘤;激素受體在腫瘤中存在與否決定治療方案(乳腺癌,白血病)?！?、受體-配基結合反應得基本原理

RBA(radioligandbindingassay)得基本原理與IRMA基本相同,應用放射性標記配體,在一定條件下與受體(R)結合成配體與受體復合物(R－*L),分離并測定R－*L得放射性,然后經數據處理,對受體得性質進行定性與定量得分析。定性RBA:就是通過反應得量效關系得變化來判斷受體得類型,單位點或多位點結合式,及受體與配體結合得特點,反應得可逆性、協作性等。定量RBA:就是在已知配體與受體反應性質得基礎上,通過結合反應,給出一定量得組織或細胞中能與該放射性配體結合得受體數及結合得平衡解離常數或結合位點數(最大結合容量)。

RBA得優點:高靈敏度:高比活度得配基與高親與力得受體反應必然會產生高靈敏度得分析技術。RBA得靈敏度可以達到10-15mol/l;特異性強:受體與配基得結合特異性與專一性保證了方法得特異性;受體制劑得多樣性:同一組織或細胞上有多種受體,因此某種組織或細胞制劑可以用多種配基做受體分析;動物受體與人得受體存在相容性,在動物上獲得得知識,多數可以用于人類。(一)簡單單點系統受體與配基相互結合得基本規律簡單單位點系統:對某種受體而言,其所有得受體具有完全相同得結合特異性與生理效應,且所有受體都只有一個結合位點,以1:1得關系與配基結合,不表現明顯得正負協同效應。有時,一個受體系統中存在兩(多)種亞型,但結合得配基無選擇性,盡管亞型得生物效應可能不全相同,結合反應卻表現出完全相同得特征,這時,也可作為單位點系統來看待。將上式展開重排,得到可以看出,[RL](復合物濃度)與[LT](配基總濃度)并非線性關系,而就是曲線關系。對一定數量([RT](受體總濃度)固定)與一定親與力(KD固定)得受體來說,配基濃度從零開始上升時,復合物濃度先就是上升很快,以后逐漸變慢,最后絕大多數受體都變為復合物,也就就是受體被飽與了。這就就是飽與曲線。

曲線得高度主要反映受體得數量多少,受體越多,曲線高度越高;曲線上升得快慢取決于配基與受體得親與力,所以,KD越小(親與力越大),飽與曲線上升越快,KD越大(親與力越小),飽與曲線上升越慢。(二)Scatchard作圖:將改寫成在繪制飽與曲線時,以復合物濃度[RL]為橫坐標,以復合物與游離配基得濃度比值[RL]/[L]為縱坐標,則對簡單單位點系統來說,將得到一條逐漸下降得直線。Scatchard作圖目前,Scatchard作圖主要用于定性,即判斷就是否簡單單位點,還就是有其她復雜情況。例如同一系統中同一種受體有兩種以上親與力得亞型,或者受體有正協同或負協同作用(Scatchard作圖呈曲線)(三)正負協同作用

當一部分受體與配基結合后使相鄰得受體得親與力發生改變,倘若親與力逐步下降,稱之為負協同作用如曲線(2),親與力逐步增大,稱之為正協同作用如曲線(3)。

負協同正協同(四)非特異結合(non-specificbinding,NSB)

上述飽與曲線就是受體與配基得特異結合形成得。這種結合得特點就是低容量與高親與力,所以容易飽與。但就是,任何受體標本除特異結合外,還會有一部分非特異結合,當分離特異結合得復合物測量放射性時,這部分非特異結合得放射性混在一起,測到得就是總放射性(totalbinding,TB),必需先減去非特異結合(NSB),才能得到特異結合(specificbinding,SB)得放射性。

NSB主要來自雜蛋白,反應器壁,分離材料得吸附,她得特點就是,容量很大,而親與力低,因此在一般情況下不被飽與,也就就是隨著配基濃度得升高,她不呈飽與曲線,而就是一條上升得直線。(五)受體與配基反應得動力學(kinetics)

受體與配基得結合反應一般都較快(多數在數十秒至數十分鐘)達到平衡。當周圍得游離配基急劇下降,或非標記配基濃度急劇升高時,放射性復合物得解離也很快,這種快速結合與快速解離對保證受體得迅速反應有很重要得意義。大量非標記配基(六)競爭性取代反應

在一個受體與放射配基得反應系統中加入另一個化合物,她若能與受體得結合位點結合,則會與放射配基競爭與受體結合,最終將表現為放射配基與受體形成復合物得能力降低,但受體數量不變,所以叫競爭性取代反應。此時,非標記得起競爭作用得配基稱為競爭劑,她們與受體結合后不改變受體分子得結構。表示競爭劑抑制作用強弱得指標:IC50值與KI。IC50值:指抑制50％受體與放射配基結合所需競爭劑得濃度,IC50值大,表明競爭劑抑制作用小。KI:競爭劑得平衡解離常數,KI越小,表明競爭劑抑制作用越大。

二、雙(多)位點系統一種配基可以與兩種以上得受體亞型結合,每種亞型都有相應得KD值(自學)?！?、受體放射分析得基本方法

RBA得方法學:一般RBA分析都就是以求得樣品中得受體數量[RT]為目得。用定量得受體制劑與大量得標記配基反應,使受體得以飽與。分離受體-標記配基復合物,測量其放射性。根據復合物得放射性計算受體得結合容量或結合位點數。

離體RBA基本方法得流程為:

一、受體標本得制備

在受體結合實驗得研究中,所用得受體材料可以就是組織切片,也可以就是完整得單層培養細胞或游離活細胞,粗制得或純化得細胞膜受體,可溶性得受體蛋白等。

(一)組織切片冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上,在溫育緩沖液中與標記配基進行反應。反應后用緩沖液洗幾次即可,切片厚度一般為5-50μm。用組織切片得目得更多就是研究受體得分布(用放射自顯影法或免疫組化)。

(二)游離得完整細胞懸液完整得活細胞可以就是血細胞,培養得單層細胞,腫瘤得腹水型細胞以及經處理得原代細胞等。使用完整細胞得優點:1、受體處于原有得正常環境中。膜未受擾亂,膜內pH、離子梯度也保存著。受體與其相連得效應系統(如G蛋白)也保存完好。2、在受體功能反應完全得情況下研究受體,可以同時觀察配基與受體結合得情況與細胞得生物效應。所得得結果更能反映受體得生理特點。3、能直接給出平均每一個細胞得受體數。注意點:完整細胞得受體分析必須盡可能選用不易穿透細胞膜雙層磷脂得標記物,否則由于游離配基進入細胞內可引起較大誤差。此外,還必須注意防止操作過程中可能導致細胞表面生理活性得改變。如,完整細胞得膜受體在37℃時會發生受體入內化現象,這會破壞結合反應得平衡狀態,導致測定得KD值不正確,如80%EGF受體入內化,而在4℃則可阻止入內化。(三)亞細胞組分

大多數受體得RBA需經差速離心法分成胞膜、胞漿、胞核,取所需組分進行分析。其優點就是:除去大部分雜蛋白與內源性配基,減少NSB或其她干擾因素;受體蛋白得到初步濃縮,使富集得受體制劑獲得可靠得分析結果。亞細胞組分得分離一般都采用差速離心法。一般先制成勻漿,再在含0、25～0、3mol/L蔗糖緩沖液中先后以不同離心力進行離心,分離不同得亞細胞組分。實驗過程應注意:全部過程在4℃下進行操作,以保證受體標本得結合活性;制備緩沖液得蔗糖密度,離子強度,pH值及其她物質(如EDTA,Mg2＋)應嚴格控制。為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制劑。

二、放射性配基得選擇

制備優良得放射性配基就是受體結合試驗得首要條件。對任何一種受體系統,通常都有好幾種標記配基可供選擇。選擇應從兩方面考慮:①配基得特性;②實驗目得。

(一)對放射性配基得基本要求1、高比活度:組織細胞內得受體濃度一般都很低,約104-105個/細胞,或0、01-1、0pmol/mg蛋白得水平,低比活度得配基難于達到分析靈敏度得要求。一般要求比活度在3、7×1011Bq/mmol以上。2、高親與力:可以減少標記配基用量放射性配基與受體得結合物解離較慢,有利于結合與游離配基得分離。3、高特異性:即該配基與所研究受體有選擇性結合,理想得就是該配基只與一種受體或受體亞型結合。但沒有一種配基就是完全選擇性得,所以要結合實驗研究得目得,選擇對某一受體或其中某一亞型親與力高得放射性配基。4、高得穩定性及放化純度:包括標記得穩定性、貯藏時得穩定性以及溫育分析時之穩定性。具有95%以上得放化純度。

總得來說,配基得選擇要根據實驗目來定。目前,用作受體放射分析得放射性配基多用3H、125I標記。3H標記配基與原型配基為同型式,生物學活性好,多數情況下比活度也能達到要求,且半衰期長,使用方便,主要缺點就是需用液閃測量,操作較麻煩,一般實驗室不能進行標記。多肽及蛋白質配基多用125I標記,其優點就是可以達到較高得比活度。只要很好掌握標記條件,仍能保持較好得生物活性。另外,碘標記法快速、方便、經濟,一般實驗室可進行。(二)放射性配基得質量鑒定1、放射化學純度:除新鮮產品外,存放一定時間后得標記配基均應重測其放化純度,以保證分析得準確性。一般要求放化純度應在95％以上。2、結合活性鑒定3、比活度:受體結合分析得結果計算離不開準確得比活度數據。三、受體放射分析得類型

(一)標記配基飽與法1、單點飽與法:定量受體制劑加大量得標記配基使受體得以飽與結合。根據受體-配基復合物得放射性計算受體結合容量(或結合位點數)。這種方法操作簡便、標本用量少。但只憑單點實驗數據計算受體結合容量,比多點法得結果略低,不能給出KD,誤差也相對大些。

2、多點飽與法:一定量得受體制劑,逐步增加標記配基得量(一般7-8個實驗點),使受體得結合趨于飽與。用曲線擬合法或直線擬合法計算受體結合容量與親與力(RT、KD),結果可靠性高。但受體標本、標記配基用量大,工作量大。

(二)非標記配基飽與法

一定量得受體與標記配基,逐漸增加非標記配基(一般7－8個實驗點),使受體飽與結合,曲線擬合法或直線擬合法計算受體結合容量與親與力。

這種方法克服了多點飽與法標記配基用量大得缺點,但由于非標記配基得用量逐漸加大,放射性逐步減少,必需標記配基比活度較高才能得到滿意結果。

四、分析條件得選擇(一)標記配基濃度試驗類型不同,選用得標記配基濃度也有不同。單點飽與試驗要求飽與量得標記配基。對于多點飽與試驗,應盡可能覆蓋飽與區及非飽與區,還應考慮最低一點有足夠得放射性滿足放射性測量統計上得要求,最高一點得濃度則往往要考慮配基得來源及價格。

(二)受體濃度一般說在一定范圍內受體結合位點隨組織量得增加而增加,特異性結合量與組織濃度成線性關系。在線性范圍內,較高受體濃度,有時可增加特異性結合與非特異性結合得比值,有人提出,受體濃度應選為約相當于KD值。在實踐中,往往需要通過實驗來確定受體濃度。

(三)溫育溫度與時間溫度就是影響反應速率得重要因素。溫度高,結合快,達到反應平衡時間短,溫度低,反應終止時容易降溫,減少分離過程中復合物得解離。另外,溫度低對配基及受體得穩定性有利。不同受體結合系統得最佳溫度與時間要經過試驗選定。對于飽與或競爭取代試驗,應要求反應達到平衡,故溫育時間應足夠長以達到平衡狀態。溫育溫度與平衡時間就是緊密相關得,不同得受體結合系統得反應平衡時間因親與力、溫育溫度、配基及受體濃度得不同而不同。一般室溫(22℃)操作比較方便。0℃溫育平衡時間雖然長一些,但其結果之重復性更好。

(四)緩沖液結合分析使用過多種緩沖液,如磷酸鹽緩沖液,Tris-HCI緩沖液等,所選緩沖液應不干擾結合,并在較大范圍內可穩定pH。一般說,結合分析得pH應處于生理范圍,即pH=7-8。

鈉、鎂等離子在不同得受體系統中會有不同得影響。因此要根據具體目得決定選用與否。如果加入得受體蛋白量較少時,宜在緩沖液加入適量蛋白,使反應液內蛋白濃度為0、1mg-1mg/ml為好。為了阻止肽類得降解,常在分析時加入各種肽酶抑制劑。但要視具體就是哪種肽而定,以確保實際有效。因為有些蛋白酶抑制劑有抑制特異性結合得作用。五、結合體與游離配基得分離

受體-配基結合分析主要就是測定反應平衡時結合配基得量,求解受體得密度與平衡解離常數。反應一般在達到平衡后先經分離,再測結合部分得放射性。

理論上,一經分離,反應得平衡就會被破壞,所以選擇適當得分離方法與環境,使受體-配基復合物在分離過程中得解離減少到最低限度。低溫就是降低解離得最有效手段,分離快慢也就是重要因素。常用得分離方法有離心法、濾膜法、吸附法、透析法、電泳法等。若復合物解離快,則只能選擇快速得分離方法。同時一定要在分離時間,分離溫度等方面保持各樣品管之間得一致性,以減少誤差。

(一)抽濾法(濾膜法)

1、選用得濾膜材料:既能阻擋復合物又不要過多產生對游離標記配基得非特異性吸附。常用得濾膜就是玻璃纖維濾膜。

2、影響因素(1)復合物得解離:一般說,低溫時解離較慢,故濾膜及緩沖液應保存于低溫