義縣高中劉占江1.2微生物的培養技術及應用高壓蒸汽滅菌液體培養基從社會中來

向經過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細菌，再經過發酵就可以制成酸奶。

一般家庭自制酸奶可能會導致腸胃不適，主要原因是有雜菌混入。

那么怎么才能保證無處不在的雜菌不混入發酵物中呢？這需要應用無菌技術和微生物的培養技術一、微生物的基本培養技術1、微生物的類群原核生物(細菌、藍細菌等)原生生物(如草履蟲、衣藻等)真菌(如酵母菌、霉菌等)酵母菌青霉菌大型真菌球菌藍細菌放線菌草履蟲衣藻病毒禽流感病毒SARS病毒一、微生物的基本培養技術2、實驗室培養微生物條件1）提供微生物生長繁殖所需營養和環境條件——培養基2）確保其它微生物無法混入——無菌技術

微生物結構簡單、形體微小，眼睛看不到，若想得到純凈的微生物，就必須對其進行培養和分離。高壓蒸汽滅菌1）細菌的形態桿菌球菌霍亂弧菌葡萄球菌螺旋菌2）微生物生長繁殖產生的菌落沙門氏菌毛霉（一）培養基的配制1、培養基概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。3、培養基類型：固體培養基液體培養基有

無

瓊脂分離、計數、鑒定等擴大培養、工業生產2、培養基作用：用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。閱讀P9回答長有酵母菌菌落盛有液體培養基（①提供微生物繁殖所需各種營養，②異養微生物的能源）劃分標準培養基種類特點用途物理性質化學成分用途（補充資料1)培養基的類型及用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業生產觀察微生物的運動、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種含化學成分不明確的天然物質工業生產培養基成分明確分類、鑒定在培養基中加入某種化學物質,以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長培養、分離出特定微生物在培養基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養基液體培養基半固體培養基固體培養基天然培養基合成培養基鑒別培養基培養基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌選擇培養基培養基+氨芐青霉素培養基

沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?4、培養基的營養構成:（1）基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽1）碳源：無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養微生物異養微生物2）氮源：無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有機物是異養型微生物的碳源、氮源、能源3）無機鹽：Ca、K、Mg為大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素凡是能夠為微生物提供C、N等元素的營養物質。表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養基的營養組成組分含量提供的主要營養牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機鹽H2O定容至1000ml水特殊營養物質：維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（2）還需滿足微生物對pH、特殊營養物質、氧氣的需求例如:培養乳酸菌要添加維生素；培養霉菌要調酸性；培養細菌要調至中性或弱堿性；培養厭氧菌要提供無氧條件。（二）無菌技術泛指在培養微生物的操作中，避免雜菌污染的方法。主要包括消毒和滅菌兩個方面：消毒對操作的空間、操作者的衣著和手滅菌培養細菌用的培養基與培養皿玻棒、試管、燒瓶、吸管和接種環等還要注意：避免已經滅菌的材料用具與周圍物品接觸為了避免周圍環境微生物污染，操作應在超凈工作臺并在酒精燈火焰旁進行。1、消毒使用較為溫和的物理、化學或生物等方法，殺死物體表面或內部一部分微生物。（1）概念：（2）消毒的方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒法：62-65℃下煮30min或80-90℃下煮30s-1min。

③化學藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手；氯氣消毒水源。

④紫外線消毒法：用紫外燈照射接種室、接種箱、超凈工作臺資料卡常用的消毒和滅菌方法2、滅菌

（1）概念：指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有微生物，包括芽孢和孢子。（2）滅菌的方法：

①灼燒滅菌：酒精燈火焰灼燒效果：最徹底原理：使微生物燃燒對象：接種工具如接種環、接種針，以及接種過程中的試管口或瓶口等易被污染部位

原理：使微生物細胞膜破壞、蛋白質變性和原生質干燥等

對象：耐高溫，需保持干燥的物品，適用于

玻璃器皿(如試管、培養皿、吸管、注射器)

金屬器具(如針頭、鑷子、剪刀等)的滅菌②干熱滅菌：干熱滅菌箱內160-170℃下加熱2-3h原理：高溫蒸汽破壞蛋白質、核酸等結構使其變性優點：操作簡便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體。基本保持培養基的營養成分不被破壞。對象：培養基等注：使用后的培養基必須滅菌后才能丟棄，以免污染環境。③濕熱滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內100kPa、121℃下維持15-30min高壓蒸汽滅菌鍋2、滅菌

（1）概念：（2）滅菌的方法：

①灼燒滅菌②干熱滅菌③濕熱滅菌

160-170℃下加熱2-3h。100kPa、121℃下維持15-30min.芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。

芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。孢子

細菌、原生動物、真菌和植物等產生的一種有繁殖作用的無性生殖細胞。能直接發育成新個體。類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養基、培養皿等,生產和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa,溫度121℃,15～30min3.無菌的方法：消毒與滅菌接種室、接種箱，超凈工作臺（三）微生物的純培養由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得純培養物的過程就是純培養。（1）概念：（2）內容：1）配制培養基2）滅菌（培養基和器具）3）微生物接種4）分離5）恒溫箱中培養酵母菌的純培養探究-實踐分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。1、菌落：2、純培養：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個微生物分散在固體培養基上，之后得到的單菌落一般是由單個微生物形成的純培養物。3、原理：微生物群分散或稀釋單個細胞單個菌落繁殖方法步驟1、制備培養基1）配制培養基稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml.2）滅菌將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15-30min.將5-8套培養皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內，在160-170℃滅菌2h.包器材倒平板的具體操作：3）倒平板待培養基冷卻至50左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。1.拔出錐形瓶的棉塞2.將瓶口迅速通過火焰3.用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基到人，立即蓋上皿蓋。4.等待培養皿冷卻后，將培養皿倒過來放置。滅菌后的培養基在無菌操作臺上倒入4個培養皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置1.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？最好不要用這個平板培養微生物。

防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。4.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。問題討論2、接種和分離酵母菌通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經過數次劃線后培養可以分離得到單菌落。(1)原理：單個細胞微生物群單個菌落連續劃線分散或稀釋生長繁殖連續劃線法分區劃線法(2)“平板劃線”實驗操作(2)“平板劃線”實驗操作1、將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅。2、在火焰旁冷卻接種環，并拔出裝有酵母菌的棉塞3、將試管口通過火焰.4、將已冷卻的接種環伸入菌液中，蘸取一環菌液5、將試管通過火焰，并塞上棉塞6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基7、灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最后一區的劃線與第一區相連8、將平板倒置放入培養箱中培養。劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）1）一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；2）存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。第1區劃線接種環滅菌第2區劃線接種環滅菌第3區劃線接種環滅菌接種環滅菌分區劃線法12345①接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次.②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環進行滅菌④劃線后,培養皿倒置培養平板劃線法注意事項:（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時,仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞殺死接種環上原有微生物問