為了棉花姓“中國”1992年，一場史無前例的棉鈴蟲災害吞噬著中國的棉田，我國棉花產業遭遇滅頂之災；國外公司拒絕出售抗蟲棉核心技術，到1999年外國抗蟲棉已占領我國95%的棉花市場份額，國內棉花品種市場迅速流失。1998年中棉所成功培育出我國第一個國審抗蟲雜交棉新品種——中棉所29，使低齡棉鈴蟲的死亡率超過90%；2002年成功培育出我國第一個雙價轉基因抗蟲棉新品種——中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲抗藥性，我國成為世界第二個擁有抗蟲基因自主知識產權的國家！第3章基因工程

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。

（1）原理：

（2）操作水平：

（3）操作環境：

（4）操作對象：

（5）結果：基因重組。分子水平。生物體外。基因。賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。

（6)優點：定向改造生物體的性狀，目的性強（與誘變育種相比）育種周期短，克服遠緣雜交不親和障礙（與雜交育種相比）2.圖解“基因工程實質”轉移A生物B生物螢火蟲普通動植物發光基因第1節基因工程的工具

第三章基因工程本節聚焦:重組DNA技術的3種基本工具是什么？

它們各具什么作用？基因工程載體需要具備什么條件？

重組DNA技術所需的三種基本工具“分子手術刀”準確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運輸車”將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞基因工程誕生的理論基礎1.拼接的基礎：2.表達的基礎：(1)DNA的基本組成單位都是

。(2)DNA分子都遵循

原則(3)雙鏈DNA分子的空間結構都是規則的

。四種脫氧核苷酸堿基互補配對雙螺旋結構(1)基因是控制生物性狀的結構和功能單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。(3)生物界共用一套遺傳密碼。1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？1.簡稱：限制酶2.來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。一、限制性內切核酸酶——分子手術刀3.限制酶的命名：

用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進一步表示成EcoRI。兩種常用的限制酶：EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個限制酶；SmaⅠ：粘質沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”4.作用(特點)：

識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵5.作用部位：特定切點上的磷酸二酯鍵G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A磷酸二酯鍵（特異性）你能根據所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身安全。

所以，簡單來說：限制酶在原核生物中起到的作用為：切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的P74拓展應用：試推測限制酶為什么不會切割自身的DNA？一、限制性內切核酸酶——分子手術刀提示：含某種限制酶的細菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上（識別序列已被修飾），使限制酶不能將其切開。思考仔細觀察以下四種限制酶識別的特定序列有何特點？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………呈現堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。6.限制酶所識別的序列的特點：7.切割結果：DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式——_________和_______黏性末端平末端①當限制酶在它識別序列的___________將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是__________；②當限制酶在它識別序列的________切開時，產生的是______；中軸線兩側黏性末端中軸線處平末端一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”12

黏性末端

黏性末端只能識別5‘GAATTC3’序列，并在G和A之間切開。被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的切割：平末端平末端SmaI限制酶的作用：只能識別5‘CCCGGG3’序列，并在C和G之間切開。當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。練習使用EcoRI剪切目的基因……TACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因1.要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？2.如果把兩種來源不同的DNA用同種限制酶來切割，會怎樣？要切2個切口，產生4個黏性(平)末端。會產生相同的黏性(平)末端思考思考與討論4.請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產生的黏性末端是否一定不同？提示

如圖同種限制酶產生的黏性末端相同，不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端。5.以下黏性末端是由__種限制酶作用產生的3學以致用思考與討論3.請結合限制酶的作用特點，回答以下問題：(1)限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能(2)請結合右圖，推斷限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？產生多少游離的磷酸基團？產生幾個黏性末端？消耗幾分子水？消耗2分子水。斷開2個磷酸二酯鍵；產生2個游離的磷酸基團；產生2個黏性末端；6.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒，已知BamHⅠ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識別序列和切點是—↓GATC—酶切結果：BamHⅠ，

。Sau3AⅠ，

。形成一個切口形成兩個DNA片段使用

（限制酶）提取目的基因Sau3AⅠG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？思考

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G思考兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來二、分子縫合針—DNA連接酶1.作用：注意：用DNA連接酶連接兩個片段之間的磷酸二酯鍵不是連接氫鍵（氫鍵的形成不需要酶的催化）DNA連接酶能夠將DNA片段連接起來2.種類：⑴E.coliDNA連接酶：⑵T4DNA連接酶：連接平末端效率遠遠低于T4DNA連接酶DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶拓展：幾種相關酶的比較名稱作用部位作用結果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈5.以下黏性末端是由__種限制酶作用產生的3學以致用思考與討論3.請結合限制酶的作用特點，回答以下問題：(1)限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能(2)請結合右圖，推斷限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？產生多少游離的磷酸基團？產生幾個黏性末端？消耗幾分子水？消耗2分子水。斷開2個磷酸二酯鍵；產生2個游離的磷酸基團；產生2個黏性末端；質粒:將外源基因送入受體細胞,使目的基因能夠在受體細胞中進行大量復制。1.作用：動植物病毒:噬菌體:2.種類：將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞將外源基因導入動植物細胞將外源基因導入大腸桿菌等細胞動物病毒噬菌體三、基因進入受體細胞的載體大腸桿菌及質粒結構模式圖三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”3.作為載體需具備的條件（1）有一個至多個限制酶切割位點目的：供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在細胞中進行自我復制或整合到受體DNA上，

隨受體DNA同步復制。（3）常有特殊的標記基因

（如四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等）目的：便于重組DNA分子的鑒定和篩選。（4）對受體細胞無害，大小合適、方便操作。有標記基因的存在，可用含青霉素的培養基鑒別。不能被酶切破壞能復制，并帶著插入的目的基因一起復制是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我

能力的環狀雙鏈DNA分子。有切割位點最常用的載體

—質粒：復制真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過

改造的。人工30標記基因的篩選原理：載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。（據圖請嘗試描述篩選的過程）關鍵點撥培養基中有幾種類型的大腸桿菌？什么樣的大腸桿菌能夠在該培養基上存活并繁殖？基因工程中的載體細胞膜上的載體蛋白本質作用基因工程中的載體與細胞膜上的載體蛋白的區別DNA分子蛋白質攜帶外源基因進入受體細胞中，并在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制運載要進出細胞的特定物質思維拓展6.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒，已知BamHⅠ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識別序列和切點是—↓GATC—酶切結果：BamHⅠ，

。Sau3AⅠ，

。形成一個切口形成兩個DNA片段使用

（限制酶）提取目的基因Sau3AⅠ…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重組DNA分子重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。注意：同種限制酶不一定是同一種限制酶(比如同兩種）。要保證切割目的片段和載體用的酶相同，這樣才能進行下一步的拼接。…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5.從以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子時，需用限制酶切

割___次此DNA分子，斷

個磷酸二酯鍵,產生____個末端,出現____個游離

的磷酸基團。6.切割目的基因和載體時，需要用_______限制酶,目的是_______________7.目的片段翻轉過來，可以連接嗎？____8.目的片段可以自身環化嗎？_____9.如何防止目的基因自身環化、防止目的基因反向連接到載體：244同種產生相同的黏性末端可以可以用不同的限制酶（通常兩種）切割目的基因的兩側及質粒，使之產生不同的黏性末端。重組DNA分子4【例1】①用圖1中的質粒和圖2中的外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。②構建重組質粒時，最好選擇限制酶BamHⅠ、HindⅢ處理質粒、外源DNA，這樣做的目的是

。SmaⅠ會破壞質粒中的抗性基因以及破壞目的基因確保目的基因與質粒的正確連接防止目的基因、質粒的自身環化及防止目的基因反向連接到載體【思考3】用限制酶切割時需注意的事項(3)選擇限制酶切割位點的基本原則：

①切割目的基因時：

。

②切割質粒時：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個完整的標記基因，便于篩選實驗：DNA的粗提取與鑒定1、實驗原理DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白質溶于酒精DNA能溶于物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下（沸水浴），DNA被二苯胺試劑染成藍色初步分離DNA和蛋白質溶解DNA鑒定DNADNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菜花和豬肝等。

（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）(1)選材：(2)試劑：①研磨液②體積分數為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現配現用2、材料用具實驗：DNA的粗提取與鑒定實驗：DNA的粗提取與鑒定稱取洋蔥，切碎，放入研缽，倒入研磨液，充分研磨。破碎細胞目的：裂解細胞，釋放DNA過濾在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取上清液。問題1:過濾能否用濾紙代替紗布？

不可以。因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。問題2:此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等。3、實驗步驟低溫放置幾分鐘的作用

抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；破碎細胞過濾DNA的析出在上清液中加入體積相等的預冷的酒精溶液,靜置2~3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。問題3:此步驟的目的是？使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。問題4：酒精預冷的作用？①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。實驗：DNA的粗提取與鑒定3、實驗步驟破碎細胞過濾DNA的析出用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。問題5：攪拌時應輕緩、并沿一個方向目的？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子析出DNA實驗：DNA的粗提取與鑒定3、實驗步驟實驗組對照組水浴加熱破碎細胞過濾DNA的析出DNA的鑒定將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min二苯胺2mol/L的NaCl空白對照：

在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。評價結果：（1）DNA純度看提取物顏色（2）DNA的量看與二苯胺反應顏色的深淺現配現用！實驗：DNA的粗提取與鑒定3、實驗步驟（1）你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結果如何？

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。二苯胺試劑鑒定呈現藍色說明實驗基本成功；如果不呈現藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。

本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。（2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？4、結果分析與評價

實驗：DNA的粗提取與鑒定實驗組水浴加熱5min，冷卻后對照組藍色

1.如果選用雞血細胞進行實驗，如何快速破碎細胞？2.有時會在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？將雞血細胞置于蒸餾水中，待細胞漲破后，收集濾液。利用蛋白酶分解雜質蛋白，不分解DNA，有利于DNA與蛋白質分開。思考雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。(1)通過基因工程產生的變異是不定向的