第2章細胞工程第2節第1課時動物細胞工程動物細胞工程（含胚胎工程）的發展歷程1890年，希普將安哥拉兔的胚胎移入比利時兔的輸卵管內，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培養了蝌蚪的神經元，首創了動物組織體外培養法1951年，張明覺等發現了哺乳動物精子的獲能現象1958年，格登用非洲爪蟾進行體細胞核移植實驗，成功培育出性成熟個體，同一時期，我國科學家童第周等開展了魚類細胞核移植工作1959年，試管家兔誕生，之后，多種試管動物相繼出生1975年，米爾斯坦和科勒等創立了單克隆抗體技術1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科學家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊1981年，埃文斯等成功分離和培養了小鼠的胚胎干細胞1996年，世界上第一只體細胞克隆羊多莉在英國誕生，隨后多種克隆動物相繼問世2006年，山中伸彌等獲得了誘導多能干細胞，我國科學家用這種細胞培育出了小鼠2014年，世界上第一個用單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生2017年，我國科學家首次培育了體細胞克隆猴2006年，山中伸彌等獲得了誘導多能干細胞，我國科學家用這種細胞培育出了小鼠動物細胞工程動物細胞培養（基礎）動物細胞融合動物細胞核移植問題探討在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產生免疫排斥反應。討論：怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養出可供移植的皮膚？

可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進行培養、擴增；目前，科學家還在研究對皮膚干細胞進行培養，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚；一、動物細胞培養概述概念：從動物體中______相關的______，將它________________，然后在_____________下，讓這些細胞_______和_______的技術；原理：__________________地位：__________________過程中的關鍵操作：__________和__________取出組織分散成單個細胞適宜的培養條件生長增殖細胞增殖（有絲分裂）動物細胞工程的基礎原代培養傳代培養一、動物細胞培養概述1234二、動物細胞培養的條件動物細胞培養的條件營養條件其他條件無菌、無毒的環境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環境糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等二、動物細胞培養的條件（1）成分①已知成分將細胞所需的__________（糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等）按其_______和________嚴格配制而成的培養基，稱為_____________。②未知成分

使用合成培養基時，通常需加入____等一些天然成分為什么？________________________________________________。（2）培養基的物理性質培養動物細胞一般使用____________，也稱為________。營養物質種類所需量合成培養基血清血清中含有尚未全部研究清楚的細胞所需的營養物質液體培養基培養液二、動物細胞培養的條件*這里的糖類不包括淀粉、蔗糖等1.營養（1）保證無菌、無毒環境的具體措施①對_______和______________進行_______處理；②在__________下進行操作；③還需要________________（2）思考題①為什么培養液需要定期更換？

_____________________________________________________②如何防止培養過程中的微生物污染？

____________________________________________培養液所有培養用具滅菌無菌環境定期更換培養液以便清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害在細胞培養液中添加一定量的抗生素二、動物細胞培養的條件2.無菌、無毒的環境（1）適宜的溫度哺乳動物細胞培養的溫度多以___________為宜；（2）適宜的pH多數動物細胞生存的適宜pH為________。（3）適宜的滲透壓維持適宜滲透壓的目的_________________________。36.5±0.5℃7.2-7.4維持細胞正常的形態和功能二、動物細胞培養的條件3.溫度、pH和滲透壓（1）組成動物細胞培養所需氣體主要有____和_____。（2）不同氣體的作用①O2：_______________________②CO2：_____________________________（3）培養容器通常采用_________或_____________。（4）培養儀器含有_________和________的混合氣體的_____________。O2CO2O2是細胞代謝所必需的CO2的主要作用維持培養液的pH培養皿松蓋培養瓶95%空氣5%CO2CO2培養箱二、動物細胞培養的條件4.氣體環境三、動物細胞培養的過程取動物組織制成細胞懸液轉入培養液原代培養分瓶傳代培養動物細胞培養過程圖解三、動物細胞培養的過程通常將_________的細胞培養，即動物組織經_____后的_________稱為原代培養；將_______的細胞培養稱為傳代培養；______體外培養的細胞需要____________________才能生長增殖，這類細胞往往貼附在培養瓶的_____上，這種現象稱為細胞貼壁；當______細胞生長到______________時，細胞通常會____________；分瓶之前處理初次培養分瓶后大多數貼附于某些基質表面瓶壁貼壁表面相互接觸停止分裂增殖三、動物細胞培養的過程①原代培養②傳代培養③細胞貼壁④接觸抑制重要名詞解釋（1）取材__________或_________的組織、器官（2）取材原因________________________________動物胚胎幼齡動物細胞分化程度低，增殖能力強，容易培養三、動物細胞培養的過程1.取動物組織（1）制成細胞懸液的步驟①_______________________②____________________________（2）將組織分散成單個細胞的原因①從動物體取出的成塊組織中，細胞與細胞________，彼此________________；②_____________________________________________。（3）將組織分散成單個細胞的方法①_______②________________________________靠在一起限制了生長和增殖將組織分散成單個細胞用培養液將細胞制成細胞懸液機械法用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間能使細胞與培養液充分接觸，更易進行物質交換三、動物細胞培養的過程2.制成細胞懸液3.酶解法較溫和，一定不會對動物細胞造成損傷，對嗎？動物細胞間的物質主要是蛋白質不可以；胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性，多數動物細胞培養的適宜pH為7.2-7.4，胃蛋白酶在此環境中沒有活性，所以用胃蛋白酶不行。不對；使用胰蛋白酶時，要控制好作用時間，因為胰蛋白酶不僅能分解細胞間的蛋白質，長時間作用還會分解細胞膜蛋白等，對細胞造成損傷。三、動物細胞培養的過程1.用胰蛋白酶分散細胞，可以說明什么問題？2.可以用胃蛋白酶處理嗎？為什么？思考（1）具體做法將__________放入_______________內（2）體外培養細胞的兩大類①___________________________；②_________________________________________________（3）兩類細胞的生長特點①懸浮生長類

_____________________________________________________②貼壁生長類________________________________________________細胞懸液培養皿或培養瓶會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質缺乏等因素而分裂受阻除受密度、有害代謝物、營養物質影響外，還會發生接觸抑制能夠懸浮在培養液中生長增殖大多數需要貼附于某些基質表面才能生長增殖（細胞貼壁）三、動物細胞培養的過程3.原代培養癌細胞；癌細胞的細胞膜上糖蛋白等物質減少三、動物細胞培養的過程“細胞增殖到互相接觸的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細胞停止繼續繁殖，出現接觸抑制的現象”試結合上述解釋，舉例說明哪種細胞無接觸抑制現象，并闡述原因。思考（1）需分瓶進行傳代培養的原因______________________________________________________________________________________________________________________________________（2）分瓶的具體做法①收集細胞

a.懸浮生長類：________________

b.貼壁生長類：____________________________________________②____________________________________________懸浮培養的細胞會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質等因素而分裂受阻，貼壁細胞在生長增殖時，除受上述因素影響外，還會發生接觸抑制現象直接用離心法收集重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養三、動物細胞培養的過程4.分瓶、傳代培養在沉淀中得到細胞，同時去掉上清液中的胰蛋白酶未體現；動物細胞培養只是細胞增殖的過程三、動物細胞培養的過程1.離心的作用？思考2.動物細胞培養技術有沒有體現動物細胞的全能性？

不可以；細胞的傳代培養一般傳至10代后就不易傳下去，這時細胞能保持細胞正常的二倍體核型；傳至10-50代左右時，增殖會逐漸緩慢，以至于完全停止，這時部分細胞的細胞核型可能會發生變化，這一階段的細胞稱為細胞株；繼續傳代培養時，少部分細胞會克服細胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細胞已經發生了突變，正在朝著等同于癌細胞的方向發展，這一階段的細胞稱為細胞系，細胞系的遺傳物質一定改變了；三、動物細胞培養的過程正常細胞能否一直傳代培養下去？思考動物胚胎、幼齡動物機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理將組織分散成單個細胞用培養液將細胞制成細胞懸液一類細胞能夠懸浮在培養液中生長增殖大多數需要貼附于某些基質表面才能生長增殖直接用離心法收集重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集三、動物細胞培養的過程取動物組織制成細胞懸液轉入培養液原代培養分瓶傳代培養四、動物細胞培養和植物組織培養的比較植物組織培養動物細胞培養原理培養前處理取材培養基的物理性質培養基的成分特有成分植物細胞的全能性細胞增殖離體用機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶將組織細胞分散開離體植物器官、組織、細胞動物胚胎或幼齡動物的組織、器官固體液體(又稱培養液)有機營養成分；無機營養成分；植物激素糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等營養物質及一些天然成分如血清植物激素血清四、動物細胞培養和植物組織培養的比較植物組織培養動物細胞培養特殊環境條件結果是否體現細胞的全能性過程相同點四、動物細胞培養和植物組織培養的比較再分化需光氣體環境一般獲得新的植株獲得大量細胞是否1.培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂；2.均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件五、干細胞培養及其應用（1）胚胎干細胞（簡稱ES細胞）①分布：存在于__________中②特點

____________________________________________________________________________________③應用實例

__________________________________________早期胚胎骨髓臍帶血胚胎干細胞成體干細胞早期胚胎具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能ES細胞在體外分化成心肌細胞、神經元細胞和造血干細胞等五、干細胞培養及其應用1.分布2.分類干細胞存在于_________、______和________等多種組織和器官中；干細胞包括____________和____________等（2）成體干細胞①分布：存在于__________________中②常見類別：包括______中的___________、_________中的__________、____中的___________等；③特點

____________________________________________________________________________________④發現最早、研究最多的、應用最成熟的實例

__________________________________________成體組織或器官內骨髓造血干細胞神經系統神經干細胞睪丸精原干細胞一般認為，成體干細胞具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的能力造血干細胞，主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血中五、干細胞培養及其應用有著_________能力及______潛能的干細胞，與__________的_______________

等密切相關；自我更新分化組織、器官發育、再生和修復類型應用造血干細胞神經干細胞誘導多能干細胞（iPS細胞）治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）可治療小鼠的鐮狀細胞貧血癥，在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展導致腫瘤發生的風險五、干細胞培養及其應用3.干細胞的應用4.干細胞應用面臨的問題存在_____________________干細胞可以被誘導分化形成新的組織細胞，經移植可使壞死或退化部位得以修復并恢復正常功能五、干細胞培養及其應用干細胞可以治療某些頑癥的原理是什么？思考六、誘導多能干細胞胚胎干細胞必須從_____中獲取，涉及________；通過體外誘導__________，獲得________________的一種細胞，稱為誘導多能干細胞，簡稱________。①誘導過程_____________②iPS細胞可以________________________，將它移植回病人體內后，理論上可以_________________；胚胎倫理問題成纖維細胞類似胚胎干細胞iPS細胞無需破壞胚胎來源于病人自身的體細胞避免免疫排斥反應*因此，普遍認為iPS細胞的應用前景優于胚胎干細胞六、誘導多能干細胞1.胚胎干細胞的局限性2.誘導多能干細胞概念3.誘導多能干細胞優點取成纖維細胞轉入相關因子細胞轉化為iPS細胞誘導iPS細胞定向分化為多種組織