沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要1等手段，從油松松針中分離得到12個(gè)化合物，譜技術(shù)，鑒定其中9個(gè)為：(13S)-15-羥基半日花烷-8(17)-烯-19-羧酸(1)、5,4'-谷甾醇(6)、胡蘿卜苷(7)、原兒茶酸(8)、10-二十九烷醇(9)。化合物1、2、3、9首次采用薄層色譜法對(duì)油松組(油松、云南松、樟松)、白皮松組(白皮松)松針中的化學(xué)成分進(jìn)行了對(duì)比研究沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文Abstract2In·thisthesis,twelvecompoundswereisolatedfromthebasisofchemicalevidenceandspectralanalysis.Thecompoundswerei(13S)-15-hydroxylabd-8(17)-en-19-oicacid(1),5,4'-dihydroxy-3methylflavone(2),naringenin(3),apigenin(4),galangin(5),β-osterol(7),protocatechuicacid(8),nonacosan-10-diol(9).ConclusionsfromPinustabulaeformisCarr.forthefTLCwasusedtoidentifyandanalyzethechemicaltabulaeformisCarr.,PinusyunnanensisFranch.,PinussylvestrisLinn.varmongolicaLitv.,PinussylvestrisLinn.var.sylvestriformisChengetC.D.Chu,PinusmassonianaLamb.,PinuskoraiensisSieb.etZucc.,PinusarmandiFranch.,PinusbungeanaZucc.exEndl,Microscopicidentificationwasusedtocomparethecrosssectpowerof8pineneedelssystematicaly.Theabovestudylaidthefouvarietyidentificationofpineneedles.Keywords:PinusL.;PinustabulaeformisCarr.;pineneedels;chemicalconstituents;沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文前言3松屬植物廣泛分布于北半球，北至北極地區(qū)，南至北非，中美、中南半島至蘇門答臘赤道以南地方。我國松屬植物分布廣泛，資源豐富，《中國約80余種，我國產(chǎn)22種10變種，分布遍布全國，其中油松、華山松、紅松、馬尾松、云南松等為我國森林中的主要樹種。目前松樹主要在荒山造林，改善生態(tài)環(huán)境，提供用材、薪碳、采脂、醫(yī)用等方面造福人類。另外引入16種2變種，其中濕地松、火炬松、加勒比松、長葉松、剛松、黑松等生長較快，均為有發(fā)展前途的造林樹種[1]。松針的價(jià)值已日益為人們所認(rèn)識(shí)，其應(yīng)用特點(diǎn)為：(1)化學(xué)成分復(fù)雜，藥理活性及臨床應(yīng)用廣泛。(2)富含多種營養(yǎng)成分及有活性的揮發(fā)性成分，據(jù)此可開發(fā)成天然保健品、抗衰老及抗癌防癌制劑；(3)可作為許多藥品的原料供應(yīng)站；(4)藥源豐富，來源廣闊，開發(fā)利用成本低廉且來自森林，受污染少。可見，松針的開發(fā)將有著巨大的潛力和深遠(yuǎn)的意義。同時(shí)，我們也應(yīng)看到，對(duì)松針的研究和開發(fā)長期停留在食品、香料、化工等行業(yè)中，對(duì)醫(yī)藥方面開發(fā)制劑較少，即處于起步階段，應(yīng)加大力度充分開發(fā)藥源，早日為人類健康作出貢獻(xiàn)。廣泛分布于東北、華北及西北地區(qū)。它的根、幼枝、葉、花粉、球果、樹皮、樹脂等皆可入藥。其針葉能祛風(fēng)，活血，明目安神，解毒止癢。國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)油松松針的化學(xué)成分研究主要集中在揮發(fā)油中的萜類成分，非揮發(fā)性的成分的研究報(bào)道較少。本文將對(duì)油松松針的非揮發(fā)性成分進(jìn)行化學(xué)研究，同時(shí)對(duì)6種松屬植物松針化學(xué)成分進(jìn)行了對(duì)比研究，并對(duì)8種松針的橫切面、表面及粉末顯微特征進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為我國松屬植物的品種鑒定和資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)。沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章松屬植物中二萜類成分的研究概況4松屬植物廣泛分布于北半球，北至北極地區(qū)，南至北非，中美、中南半島至蘇門答臘赤道以南地方。我國松屬植物分布廣泛，資源豐富，《中國植物志》記載松屬植物約80余種，我國產(chǎn)22種10變種，分布遍布全國，其中油松、華山松、紅松、馬尾松、云南松等為我國森林中的主要樹種。目前松樹主要在荒山造林，改善生態(tài)環(huán)境，提供用材、薪碳、采脂、醫(yī)用等方面造福人類。另外引入16種2變種，其中濕地松、火炬松、加勒比松、長葉松、剛松、黑松等生長較快，均為有發(fā)展前途的造林樹種[1]。通過對(duì)文獻(xiàn)的查閱，了解了近20年來松針的化學(xué)成分研究情況.1.1松屬植物中二萜類成分的研究松屬植物化學(xué)成分研究涉及植物的樹皮、松脂、針葉、花粉、種子等，現(xiàn)已從該屬植物中分離鑒定了各種類型的化合物，其主要為萜類化合物。另外還含有黃酮及其苷類、苯丙素類、二苯乙烯類和多酚類化合物等，其中二萜類成分是松屬植物的主要成分，具有多種生理活性。本文針對(duì)松屬植物中二萜類成分的研究情況進(jìn)行綜述。1.1.1半日花烷型二萜序號(hào)名稱化合物結(jié)構(gòu)文獻(xiàn)122232542526373839methylabeoanticopa3363334047004oo40045585666798888沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章松屬植物中二萜類成分的研究概況序號(hào)名稱化合物結(jié)構(gòu)142O300456舌""舌""78009工工HO000o0oOO00OO序號(hào)名稱化合物結(jié)構(gòu)192m3"45"67"o9m0m0mOmO沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章油松松針的化學(xué)成分研究第二章油松松針的化學(xué)成分研究2.1概述松科(Pinaceae)植物油松(PinustabulaeformisCarr.)是我國特有樹種，廣泛分布于我國華北、西北各省區(qū)。其針葉藥用價(jià)值歷史悠久，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、疥瘡、跌打損傷、失眠等，廣泛用于食品、添加劑、保健品等方面。松針提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、調(diào)血脂、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤等活性，但針對(duì)其化學(xué)成分的研究主要集中在揮發(fā)油成分上，非揮發(fā)性成分的研究報(bào)道較少。本文對(duì)油松松針的非揮發(fā)性成分進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)研究，從中分離了12個(gè)化合物，通過化學(xué)及波譜學(xué)手段，鑒定了其中9個(gè)化合物，分別為：(13S)-15-羥基半日花烷化合物1、2、3、9為首次從該屬中分離得到，化合物4~8為首次從該植物中分離得到。沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章油松松針的化學(xué)成分研究3456沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章油松松針的化學(xué)成分研究892.2化合物結(jié)構(gòu)鑒定化合物1:白色無定形粉末(三氯甲烷-甲醇),10%硫酸乙醇液顯色為紫紅色，ESI-MS給出偽分子離子峰m/z345.0[M+Na]*,結(jié)合碳譜數(shù)據(jù)分析，確定分子式為C??H??O?。'H-NMR譜(600MHz,CDCl)給出了三個(gè)甲基峰信號(hào)，分別為δ0J=6.3Hz,16-CH?)、1.22(3H,s,18-CH?);還觀察到一個(gè)羥甲基信號(hào)δ3.61-3.70(2H,m,H-15);在低場區(qū)還可見末端雙鍵質(zhì)子信號(hào)δ4.49(1H,brs,H-17a)、4.83(1H,brs,H-17b)。13C-NMR譜中給出了一個(gè)羧基碳信號(hào)δ183.1(C-19),表明有一個(gè)羧基取代。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的(13S)-15-hydroxylabd-8(17)-en-19-oicacid數(shù)據(jù)一致，化合物2:黃色針狀結(jié)晶(三氯甲烷-甲醇)。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，推測該化合物為黃酮類化H-2',H-6)示為B環(huán)AA'BB'偶合系統(tǒng)的氫信號(hào)；83.81(3H,s,OCH?)、3.89(3H,s,OCH?)、3.91(3H,s,OCH?)給出了三個(gè)甲氧基信號(hào)；δ2.06(3H,s,6-CH?)示為甲基氫信 (5,4'-dihydroxy-3,7,8-trimethoxy-6-C-methylflavone)。結(jié)構(gòu)式如下：化合物3:淺黃色粉末(三氯甲烷-甲醇),鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽86.80(2H,d,J=8.5Hz,H-3',5)、7.31(2H,d,J=8.5Hz,H-2',6)示為B環(huán)上AA'BB’偶合系統(tǒng)的氫信號(hào)；85.88(2H,brs,H-6,8)示為A環(huán)上兩個(gè)間位質(zhì)子信號(hào)，歸屬為A環(huán)上的H-6和H-8;δ5.44(1H,dd,J=12.8,3.0Hz,H-2)示為C環(huán)上的2位質(zhì)子氫信號(hào)；δ2.68(1H,dd,J=17.1,3.0Hz,H-3a)、3.26(1H,dd,J=17.1,12.8Hz,H-3b)示為C環(huán)上3位的兩個(gè)質(zhì)子氫信號(hào)，推測該化合物為二氫黃酮。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的柚皮素?cái)?shù)據(jù)一致，故鑒定化合物3為柚皮素(naringenin)。結(jié)構(gòu)式如下：沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章油松松針的化學(xué)成分研究H-6)、6.49(1H,d,J=2.1Hz,H-8)示為A環(huán)上兩個(gè)間位質(zhì)和H-8。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的芹菜素?cái)?shù)據(jù)一致，故鑒定化合物4為芹菜素 6.22(1H,d,J=2.1Hz,H-6)、6.48(1H,d,J=2.1Hz,H-8)示為A環(huán)上兩個(gè)間位質(zhì)子信號(hào)，化合物6:數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為β-谷甾醇(β-sitosterol)。化合物7:白色無定形粉末(三氯甲烷-甲醇)。Libermann-Burchard反應(yīng)陽性。與胡蘿卜苷對(duì)照品進(jìn)行TLC對(duì)照，多種展開系統(tǒng)下Rf值均一致，故鑒定化合物7為胡蘿卜苷化合物8:白色針狀結(jié)晶(三氯甲烷-甲醇)。溴甲酚綠反應(yīng)陽性，表明化合物含有羧基；三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng)陽性，表明化合物含酚羥基；H-NMR(300Hz,DMSO-d6)譜顯示δ12.30(1H,brs)為羧基氫信號(hào)；δ9.47(2H,brs)為兩個(gè)酚羥基氫信號(hào)；δ6.78(1H,d,J=8.1Hz,H-5)、7.29(1H,dd,J=8.1,2.1Hz,H-6),7.34(1H,d,J=2.1Hz,H-2)為芳環(huán)上ABX偶合系統(tǒng)的氫信號(hào)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的原兒茶酸數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章油松松針的化學(xué)成分研究化合物9:白色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)。H-NMR(300Hz,CDCl?)譜δ0.88(6H,t,J=6.0Hz)示為兩個(gè)甲基氫信號(hào)；δ3.55(1H,m)示為連氧碳上的氫信號(hào)；另外在δ1.00-1.50之間可見52個(gè)脂肪氫信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的10-羥基二十九烷基本一致，故鑒定化合物9為10-羥基二十九烷(nonacosan-10-diol)。結(jié)構(gòu)式如下：2.3實(shí)驗(yàn)部分2.3.1儀器與材料2.3.1.1儀器Bruker-ARX-300核磁共振光譜儀(TMS內(nèi)標(biāo)，瑞士Br2.3.1.2材料薄層色譜硅膠GF-254(10～40μm,青島海洋化工廠)聚酰胺薄膜(浙江臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)柱色譜硅膠(50～75μm,青島海洋化工廠)聚酰胺(150~75μm,浙江臺(tái)州路橋四清生化材料廠)ODS(YMC-PackODS-A型，批號(hào)7943)SephadexLH-20(GEHealthcareBio-sciences產(chǎn)品，批號(hào)1004823)DMSO-d6(美國)為山東青島微波科技有限公司分裝石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇(分析純，天津市博迪化工有限公司),CDCl?(山東青島微波科技有限公司),DMSO-d?(山東青島微波科技有限公司)2.3.1.3藥材2.3.2化學(xué)成分的提取與分離新鮮松針在室溫下陰干后粉碎，取藥材粉末5kg,加體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇回流提取3次，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇。濃縮浸膏用適量水混懸后，依次以等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取3次，得石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層5部分。實(shí)驗(yàn)流程如Chart2.2所示petroleumether,CHCl?,EtOAc,n-BuOHthesamevolumefor3times,Chart2.2Extractionandse取石油醚部分222g,經(jīng)水蒸氣蒸餾，將揮發(fā)油除去。剩余的非揮發(fā)成分經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜檢測，合并相似流份，F(xiàn)r.48-68部分經(jīng)反復(fù)柱色譜，采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，將析出的結(jié)晶過濾，用石油醚洗滌，經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物9(278mg)。Fr.165-188經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，凝膠柱色譜純化得到化合物6(89mg)。Fr.372-375部分經(jīng)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，凝膠柱色譜純化得到化合物7(175mg)。過程如Chart2.3所示：Chart2.3IsolationprocessofconstituentsfromP取氯仿萃取物170g,經(jīng)聚酰胺柱色譜，以二氯甲烷，甲醇分別洗脫，二氯甲烷部分94g經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，合并相似流份，F(xiàn)r.20-28部分經(jīng)硅膠柱色譜、凝膠柱色譜得到化合物2(55mg)。Fr.29-3聚酰胺柱色譜、凝膠柱色譜得到化合物3(12mg)胺柱色譜、凝膠柱色譜得到化合物4(15mg)。Fr.36-39部分經(jīng)硅膠柱色譜、凝膠柱色譜得到化合物5(26mg)。Fr.40-47部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜、凝膠柱色譜得到化合物1(18mg)。Fr.48-52部分經(jīng)硅膠柱色譜、ODS、凝膠柱色譜得到化合物8(29mg)過程Fr.20-28Fr.29-32Fr.33-35Fr.36-39Fr.40-47Chart2.4IsolationprocessofconstituentsfromCHCl?ext2.3.3化合物的波譜數(shù)據(jù)化合物2;5,4'-dihydroxy-3,7,8-tri黃色針狀結(jié)晶(三氯甲烷-甲醇),'H-NMR譜(600MHz,DMSO-d6)δ:2.06(3H,淺黃色粉末(三氯甲烷-甲醇),'H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:2.68(1H,dd,J=黃色針狀結(jié)晶(三氯甲烷-甲醇),H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:6.20(1H,d,J=2.1Hz,H-6)、6.48(1H,d,J=2.1Hz,H-8)、7.55(3H,m,H-3',4無色針狀結(jié)晶(三氯甲烷),H-NMR(600Hz,CDCl?)δ:0.68(3H,s,18-CH?)、白色針狀結(jié)晶(三氯甲烷-甲醇),H-NMR(300Hz,DMSO-d6)6:12.30(1H,沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章油松松針的化學(xué)成分研究白色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯),'H-NMR(300Hz,CDCl?)δ:0.88(6H,t,J=沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章松屬植物針葉中化學(xué)成分的對(duì)比研究3.1儀器與材料3.1.1儀器KQ-50E型超聲儀(昆山市超聲儀有限公司),98-1-B型電子調(diào)溫電熱套3.1.2材料薄層色譜硅膠GF-254(10～40μm,青島海洋化工廠)石油醚(沸程60-90℃)、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、pH試紙(杭州特種紙業(yè)有限公司)3.1.3藥材 3.2樣品制備2g藥材加20ml石油醚超聲提取20分鐘，過濾，濾液加100ml蒸餾水進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸出約50ml水。餾出液用分液漏斗分液，將石油醚層揮干，用三氯甲烷轉(zhuǎn)移制備樣品FA(揮發(fā)性成分)。剩余液用乙醚萃取兩次，每次15ml。合并乙醚層用5%氫氧化鈉溶液萃取2次，每次15ml,取乙醚層用蒸餾水萃取2次，每次15ml。乙醚層用無水硫酸鈉脫水，揮干，用三氯甲烷轉(zhuǎn)移制備樣品FB(中性成分)。堿水層用濃鹽酸調(diào)pH至2(溶液由澄清變?yōu)榛鞚?,將酸水層用乙醚萃取2次，每次15ml。合并乙醚層用蒸餾水萃取2次，每次15ml,將乙醚層用無水硫酸鈉脫水，揮干，用三氯甲烷轉(zhuǎn)移制備樣品FC(酸性成分)。3.3揮發(fā)性成分的TLC研究3.3.1色譜條件薄層板：硅膠GF254薄層板展開劑：石油醚-乙酸乙酯(17:3)沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章松屬植物針葉中化學(xué)成分的對(duì)比研究點(diǎn)樣：各供試液分別點(diǎn)樣5μ1展開方式：展開箱預(yù)平衡15分鐘，上行展開，展距：8cm顯色：噴以20%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，可見光下檢視。圖3.1揮發(fā)性成分的薄層圖3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖譜可見，在Rf=0.33,Rf=0.50,Rf=0.86左右有三組共有斑點(diǎn)。油松、樟子3.4中性成分的TLC研究3.4.1色譜條件薄層板：硅膠GF254薄展開劑：石油醚-乙酸乙酯(9:1)點(diǎn)樣：各供試液分別點(diǎn)樣5μ1展開方式：展開箱預(yù)平衡15分鐘，上行展開，展距：8cm顯色：噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，可見光下檢視。沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章松屬植物針葉中化學(xué)成分的對(duì)比研究4.白皮松圖3.3中性成分的薄層圖3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖譜可知，在Rf=0.15,Rf=0.5,Rf=0.76左右有三組共有斑點(diǎn)。油松、樟子松、云南松為油松組，中性成分斑點(diǎn)相似。華山松和紅松為五針?biāo)山M，中性成分斑點(diǎn)一致，且在Rf=0.63處有區(qū)別于油松組和白皮松的特征斑點(diǎn)。白皮松和油松組的中性成分斑點(diǎn)相似，說明白皮松組與油松組親緣關(guān)系較近。3.5酸性成分的TLC研究3.5.1色譜條件薄層板：硅膠GF254薄層板展開劑：氯仿-丙酮-甲酸(16:4:1)點(diǎn)樣：各供試液分別點(diǎn)樣5μl展開方式：展開箱預(yù)平衡15分鐘，上行展開，展距：8cm顯色：噴以20%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，可見光下檢視。沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章松屬植物針葉中化學(xué)成分的對(duì)比研究2.樟子松3.云南松4.白皮松5.華山松6.紅松圖3.2酸性成分的薄層圖3.5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖譜可知，在Rf=0.36,Rf=0.94處均有斑點(diǎn)，但顏色差異較大，是否為共有3.6小結(jié)通過對(duì)比研究，確定超聲提取，水蒸氣蒸餾和酸堿萃取為揮發(fā)性成分、非揮發(fā)性成分)的最佳制備工藝。在萃取非揮發(fā)性成分中酸性成分時(shí)