微生物在藥學中的應用醫用抗生素得特點差異毒力大對作用對象與對機體得毒性之間得差異越大越好由作用機制決定生物活性強、有不同得抗菌譜生物活性用MIC來表示,其值越小表示作用越強能抑制或殺滅得微生物范圍稱為抑菌譜,有廣譜和窄譜之分二、抗生素得分類根據產生來源分細菌產:少,有多粘菌素、短桿菌肽等放線菌產:多,鏈霉素更主要真菌產:青霉素,頭孢霉素等動物植物產:地衣素,蒜素,魚素等根據化學結構分Beta-內酰胺環類大環內酯類氨基糖苷類四環素類多肽類第二節抗生素產生菌得

分離與篩選目前,新抗生素得獲得大致有如下途徑:1、從自然界分離并篩選新抗生素產生菌。近年來,為了擴大篩選得來源,已從土壤微生物擴展到海洋微生物,從一般常見微生物擴展到極端微生物,又從微生物擴展到植物、海洋生物等。2、改造現有得已知抗生素得產生菌,再經篩選獲得新抗生素產生菌。3、從已知得抗生素進行結構改造,經篩選后獲得新得半合成抗生素。4、采用新得篩選方法,如培養超敏細菌以尋找微量得新抗生素,選用新得腫瘤模型,如用鼠肉瘤病毒M(MSV、M)、鳥類粒白細胞血病病毒等來篩選抗腫瘤抗生素。5、采用現代分子生物學技術設計新抗生素。絕大多數抗生素得原始產生菌就是從自然界分離篩選而得,因此,下面以傳統得分離土壤放線菌為例,簡單說明新抗生素產生菌得常規分離和篩選過程。

一、土壤微生物得分離1、采土2、分離菌株二、篩選所謂篩選就是指從大量待篩選放線菌中,盡快地鑒別出極少數有實用價值得抗生素產生菌得實驗過程。在新抗生素產生菌得篩選中,應根據篩選目得選擇合適得篩選模型和方法。1、篩選模型篩選模型就是指篩選工作中所使用得試驗菌。2、篩選方法抗菌抗生素一般采用瓊脂擴散法。

三、早期鑒別1、抗生素產生菌得鑒別2、抗生素得鑒別四、分離精制五、臨床前試驗研究六、臨床試驗第三節抗生素得制備

一、發酵階段(一)現代膽色素發酵得一般特點1、需氧發酵2、深層發酵3、純種發酵

(二)一般生產流程

1、孢子制備

2、種子制備3、發酵

(1)無菌操作(2)營養需要(3)PH(4)溫度(5)前體(6)通氣、攪拌及消沫(7)發酵終點判斷二、發酵液預處理及提取階段(一)發酵液預處理(二)提取常用得提取法主要有以下幾類。1、容媒萃取法2、離子交換法3、沉淀法4、吸附法大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜援助古巴可拆卸式中試發酵車間

大連翔大科技股份有限公司中試及大規模生產發酵車間

山東勝利股份有限公司生物工程技術中心生物農藥中試發酵車間

華中農大中試發酵車間

內蒙古華蒙金河生物技術有限公司(飼料用抗生素——金霉素,西部開發項目)

上海聯合賽爾生物工程公司國家一類新藥霍亂疫苗發酵生產車間

第四節抗生素得生物合成機制一、次級代謝產物得概念所謂次級代謝產物(secondarymetabalites)就是指那些由微生物合成得,但對微生物得生長、繁殖無明顯功能得各種代謝產物,如抗生素等。次級產物有以下幾個特點。1、對微生物得生長、繁殖無明顯功能。2、與初級代謝產物緊密相聯。3、在一定條件下能大量合成。

二、抗生素生物合成得代謝途徑大致步驟:營養物質—?初級代謝中間物—?前體—?修飾重排—合成途徑—?抗生素有關代謝途徑脂肪酸代謝氨基酸代謝嘌呤嘧啶代謝糖代謝芳香族合成一碳甲基庫三、青霉素得生物合成及調控6-APA生物合成得調控賴氨酸得反饋抑制糖分解產物得阻抑作用葡萄糖分解產物?抑制酰基轉移酶?抑制青霉素合成乳糖不抑制,但成本高生產中用滴加或間隙補加以維持低濃度糖第五節抗生素得主要作用機制1、抑制細胞壁得合成青霉素類抑制細胞壁肽聚糖得交叉連結→細胞壁缺損→水分內滲→細菌膨脹變形→細菌破裂、溶解。環絲氨酸:抑制五肽得形成萬古霉素和桿菌肽:前者阻斷二糖五肽與胞壁受體結合;后者影響內脂循環Bata內酰胺類抗生素:抑制合成交聯中所需得轉肽酶反應,使不能形成三維結構2、影響胞漿膜通透性多粘菌素與細胞膜內磷酯結合→細胞膜通透性↑→細胞內重要物質外漏→細菌死亡。制霉素、二性霉素B:與真菌細胞膜麥角固醇結合→形成孔道→細胞內重要物質外漏→真菌死亡。3、抑制蛋白質合成氨基甙類:〔1〕抑核蛋白體70S始動復合物得生成〔2〕與核蛋白體30S得P10蛋白結合→翻譯錯誤。〔3〕阻止釋放因子與核糖體結合抑制蛋白質得釋放抗菌藥不影響人蛋白質得合成因人與細菌得核蛋白體不同。細菌:70S(原核細胞)30S50S人:80S(真核細胞)40S60S4、影響核酸代謝利福平:抑制依賴于DNA得RNA多聚酶,從而抑制得mRNA合成氟喹諾酮類:抑制DNA螺旋酶→抑制DNA復制與mRNA得轉錄。5、抗葉酸代謝磺胺類抑制二氫葉酸合成酶,TMP(甲氧芐啶)抑制二氫葉酸還原酶,從而抑制DNA、RNA得合成。第六節抗藥性一、基本概念最小抑菌濃度固有性抗藥獲得性抗藥多重抗藥性交叉抗藥性賴藥性二、產生得遺傳學機制自發突變,藥物選擇壓力抗藥基因轉移三、產生得生物化學機制1、產生滅活酶(1)水解酶:b—內酰胺酶水解青霉素或頭孢菌素得b－內酰胺環。(2)鈍化酶:催化某些基團結合到抗生素得OH、NH2上

,使之失去抗菌活性,如G－桿菌對氨基甙類耐藥。2、改變靶位結構〔1〕藥物與靶位親和力↓:如β－內酰胺類與PBPS結合↓。〔2〕靶位結構改變:

①耐甲氧西林得金葡菌產生PBP2,(MRSA)

②鏈霉素:P10蛋白改變

③利福平:RNA多聚酶β亞基得改變3、降低外膜通透性細菌細胞膜存在特異通道與非特異通道,當通道得通透性↓→耐藥。(1)細菌孔道蛋白質組成、數目、功能改變:如G－桿菌對氨基甙類耐藥。(2)產生新得蛋白質堵塞孔道:如細菌對四環素耐藥。4、通過主動泵出系統清除藥物細菌:大腸桿菌、金葡菌、表葡菌、銅綠假單孢菌、空腸彎曲菌等。抗菌藥:四環素、氟喹諾酮類、氯霉素、β-內酰胺類等通過主動泵出而耐藥。5、其她代謝拮抗物↑:如對磺胺類耐藥得細菌產生大量得PABA。耐藥性產生得人為原因(1)濫用(2)局部用(3)劑量不足(4)單獨用(5)長期用四、對細菌耐藥性得對策合理使用抗菌藥1、應用抗菌藥要有嚴格指征2、足量用藥、療程要適當3、治療慢性病要聯合用藥4、不要局部用藥研制新藥加強耐藥機制研究第七節抗生素得效價、單位和效價測定一、抗生素得效價和單位效價:相同條件下檢品與標準品得抗菌活性之比值效價=檢品抗菌活性

標準品抗菌活性×100%單位

衡量有效成分得具體尺度,可以各不相同重量單位:抗菌活性部分得重量,非全部鹽類成分。如鏈霉素硫酸鹽、土霉素鹽酸鹽、新生霉素鈉(鉀)鹽類似重量單位:全部鹽類成分。如純金霉素鹽酸鹽、四環素鹽酸鹽等,1微克＝1單位重量折算單位:青霉素,以抑制50毫升得金葡菌者為1單位,相當于純品0、5988微克,則1毫克＝1670單位特定單位:特定批次樣品得某一重量為一單位。如某批桿菌肽1mg=55單位,制霉菌素1mg=3000單位標準品:與商品同質,純度較高得抗生素,每毫克含一定單位,可作效價測定之標準國際單位:經國際協議,每毫克含一定單位得標準品稱國際標準品,其單位稱國際單位。國際標準品由WHO得生物檢定專家委員會主持,由英國國立生物標準檢定所組織標定、保管、分發。國家標準品標示量:標簽上得標示量原則上以重量表示,成分不清(如制霉菌素),或照顧用藥習慣(青霉素),仍沿用單位表示二、抗生素效價得微生物學測定法抗生素效價得生物測定有稀釋法、比濁法、擴散法三大類。管碟法就是擴散法中得一種,本法就是利用抗生素在瓊脂培養基得擴散滲透作用,將已知濃度得標準溶液與未知濃度得樣品溶液在含有敏感性試驗菌得瓊脂表面進行擴散滲透,比較兩者對被試菌得抑菌作用,求出抑菌圈得大小,以測定抗生素得濃度。在一定范圍內,濃度與抑菌圈直徑在雙周半對數表上(濃度為對數值,抑菌圈直徑為數字值)成直線函數得關系,由此繪制成標準曲線,從樣品得抑菌圈大小可在標準曲線上求得其效價。由于本法就是利用抗生素抑制敏感細菌得特點,所以符合臨床使用得實際情況,而且靈敏度也很高,不需特殊設備,故一般實驗室及生產上多采用此法。但此法也有缺點,即操作步驟多,手續繁雜,培養時間長、得出結果慢。盡管如此,由于她有上述得獨特優點而被世界各國所公認,成為國際通用得方法被列入各國藥典法規得范圍內。測定方法:一劑量法二劑量法三劑量法影響因素第十八章微生物在其她藥物生產中得應用第一節維生素一、維生素C化學合成法——萊氏法,國外用生物合成——二步發酵法,中國用1、D-葡萄糖——D-山梨醇——L-山梨糖:弱氧化醋桿菌2、L-山梨糖——2-KLG:大小菌二、維生素B2棉病囊霉:4000～8000毫克/升阿舒假囊酵母:4000毫克/升三、維生素B12肝臟提取化學合成丙酸桿菌成本太高,不適宜工業化生產第二節氨基酸谷氨酸發酵我國得菌株:北京棒狀桿菌;鈍齒棒狀桿菌生物素:過少,菌不長;過多則為乳酸發酵氧:充足時谷氨酸發酵;不足時乳酸發酵NH4+:適量時谷氨酸發酵;不足時生成a-酮戊二酸;過量時生成谷氨酰氨pH中性和偏堿性時生成谷氨酸;酸性時生成乙酰谷氨酰氨2、賴氨酸高絲氨酸營養缺陷兼抗性突變株賴氨酸天冬氨酸激酶第三節酶及酶抑制劑酶:有催化作用得蛋白質,新陳代謝必不可少得催化劑酶得用途治療疾病診斷試劑生物工具酶一、酶制劑臨床上較常用得微生物酶鏈激酶、鏈道酶:心血管病治療。鏈球菌生產透明質酸酶:治心肌梗死。從動物血漿及動物毒液中提取天冬氨酰胺酶:治療白血病、腫瘤。許多菌均可青霉素酶:含青霉素制劑得無菌檢測工業上較常用得微生物酶:青霉素酰化酶分解青霉素,得到6-氨基青霉烷酸(6–APA),就是半合成青霉素得母核二、酶抑制劑為具有生物活性得小分子化合物中和抑制或競爭抑制某些酶得活性調節代謝活動:防病、治病如鏈霉產生得泛誕菌素,抑制淀粉酶,防止肥胖癥、糖尿病等第四節甾體化合物得生物轉化甾體化合物具有機體調節作用,可用于治病:腎上腺皮質激素治療或緩解膠原性疾病、過敏性休克性激素:治療性器官功能衰退與某些婦科疾病乳腺癌、前列腺癌得輔助治療藥物口服避孕藥得主要成分微生物轉化載體化合物得反應類型羥化反應2、環氧化反應3、脫氫反應4、側鏈得降解？微生物生產甾體化合物得方法:單相發酵法雙相發酵法固定化酶法轉化者培養好得微生物分離后得菌懸液固定化酶或細胞提取底物菌體與培養液菌體與液體過柱液優缺點發酵易、提取難發酵繁、提取易發酵繁、提取易第五節其她微生物制劑核酸類藥物生物堿微生態制劑螺旋藻基因工程產品微生物與藥物變質藥物中微生物得來源1、空氣細菌、霉菌、酵母菌無菌操作區－每1000升空氣中<10個細菌。2、水3、其她原料、容器、設備、操作人員、包裝材料。微生物引起得藥物變質1、藥物變質得判斷(1)有病原微生物存在(2)存在微生物得毒性代謝產物(3)產品發生可被覺察得物理或化學變化(4)口服及外用藥物得微生物總數超標(5)無菌制劑中發現有微生物存在2、藥物變質得結果(1)變質得藥品引起感染(2)藥物理化性質得改變引起藥物失效(3)藥物中得微生物產生有毒得代謝產物3、影響藥物變質得因素污染量營養因素含水量pH值儲藏溫度防止微生物污染藥物得措施1、加強藥品生產管理(GoodManufacturingPractice)交叉污染容器貼錯標簽2、進行微生物學檢驗3、使用合格得防腐劑藥物得體外抗菌試驗用于抗菌藥物得篩選提取過程中得追蹤抗菌譜得測定藥物含量得測定藥物血濃度測定藥物敏感試驗等包括抑菌試驗和殺菌試驗兩者并非絕對體外抑菌試驗一、連續稀釋法

可用于測定藥物得最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration)和最低殺菌濃度(minimalbactericidalconcentration)、一、連續稀釋法21、液體培養基連續稀釋法2、固體培養基連續稀釋法——平板法可同時測定大批量試驗菌株得MIC,且不受藥物顏色及混濁度得影響。MIC檢測方法1、藥液稀釋:對倍稀釋法共14管,12管為空白對照(不加菌液),13管為陽性對照(不加藥物)。14管為稀釋劑或助溶劑對照(濃度與1管相同)。2、加入菌液0、1毫升(1000～100000個細菌),搖勻。3、培養:37度,16～24小時。4、MIC得確定:試驗管呈現澄明得最低藥物濃度即為MIC。二、瓊脂擴散法1、濾紙片法新藥得初篩及臨床得藥敏試驗2、打孔法藥物血濃度得檢測3、挖溝法一種藥物對幾種試驗菌得抗菌作用體外殺菌試驗最低殺菌濃度(MBC)也可稱之為最低致死濃度(MLC)。取MIC終點以上未長菌得各管培養液,分別移種于另一無菌平板上,培養后平板上無菌生長(或少于5個菌落)得藥物最低濃度為該藥得MBC(或MLC)。聯合抗菌試驗兩種抗菌藥物、藥物與不同pH、藥物與不同離子溶液得相互影響。1、協同－加強作用2、拮抗－減弱作用3、無關－相互無影響4、累加－作用為二者之和一、紙條試驗在已接種試驗菌得平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液得濾紙條,培養后根據抑菌區得加強、減弱或無影響來判斷她們在聯合應用時得效應。二、棋盤格法A藥各稀釋度按縱行定量加入各管。B藥各稀釋度按橫排定量加入各管。加入定量菌液,經培養后觀察結果。兩藥同時檢測單獨MIC。FIC(A)＝A藥與B藥聯合試驗時A藥得MICA藥單獨試驗時得MICFIC為部分抑菌濃度FIC(B)＝B藥與A藥聯合試驗時B藥得MICB藥單獨試驗時得MICFIC指數＝FIC(A)+FIC(B)

<0、75－協同1－累加1～2－無關

>2－拮抗體外抗菌試驗得影響因素1、試驗菌標準菌株臨床新分離菌株2、培養基3、抗菌藥物濃度稀釋4、對照試驗(1)試驗菌對照(2)已知藥物對照(3)溶劑及稀釋液對照藥物制劑得微生物學檢查一、無菌制劑得無菌檢查各種注射劑(針劑、輸液)手術及眼科制劑都必須無活得微生物。1、無菌檢查得基本原則采用嚴格得無菌操作方法,將被檢藥品置不同培養基內培養,觀察有無微生物生長,以判斷被檢藥品就是否合格。2、無菌檢查抽樣(1)百分數抽樣法:每批得2％～5％(2)固定抽樣法:2～203、培養基及培養基靈敏度試驗無菌試驗靈敏度試驗:用已知不同菌株做生長試驗來監控。菌種有:藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。4、陽性對照菌及抑細菌抑真菌試驗(1)陽性對照菌液就是為供試品做陽性對照試驗使用得。其目得就是檢查陽性菌在加入供試品得培養基中能否生長,以驗證供試品有無抑菌活性物質和試驗條件就是否符合要求。(2)抑細菌抑真菌試驗:加供試品得培養管與未加供試品得培養管比較,以判斷供試品有無抑菌作用。(如有抑菌作用可加入滅活劑或用薄膜過濾法檢測)5、檢查法(1)直接接種法:適用于非抗菌作用得供試品。(2)薄膜過濾法:適用于有抗菌作用得或大容量得供試品。特殊藥品得無菌檢查法油類藥物得無菌檢查供試品中加入1％～3％聚山梨酸80(吐溫80),其作用就是使油類藥物均勻分散,便于檢出微生物。

細菌總數得測定口服藥及外用藥得微生物學檢查需要限制性控制微生物得數量和種類。1、細菌總數、霉菌總數低于規定限量(細菌總數1克或1毫升不超過10～104CFU,真菌數1克或1毫升不超過10～103CFU)。2、口服藥物不得檢出大腸埃希菌、沙門菌。3、外用藥不得檢出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、破傷風梭菌。4、不得檢出活螨(含糖得劑型應重點檢查)。平板菌落計數法限制條件1、菌落形成單位(colonyformingunits,CFU)為計數單位。一個菌落就就是一個菌落形成單位,她可以由一個也可以由多個菌細胞形成。2、受特定培養基和培養條件限制普通培養基,需氧或兼性厭氧,30～35度,48小時。3、有繁殖能力得菌細胞才能