關于蛋白質合成分離第1頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日意義解析蛋白質結構與功能的關系，為應用及人工合成蛋白質提供全面信息；許多肽具有獨特的生物學活性，是目前合成的主要物質；第2頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第一節肽合成合成肽的方法有三類第一類是由不同氨基酸按照一定順序的控制合成；第二類是由氨基酸自由共聚；第三類由酶催化在非水介質中合成。第3頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日

第一類是目前合成肽的主要方法，該方法在合成前必須先將不參與形成肽鍵的活潑基團保護起來。例如，羧基可用活性酯法（酰氯），氨基可以采用碳二亞胺法形成卞氧甲酰胺，合成后再將保護基水解下來。最后分離產物。第4頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第5頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第6頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第7頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日80年代，開發出固相合成技術。合成肽鏈時，在聚苯乙烯樹脂小珠固相上進行。⑴待合成的第一個氨基酸的羧基先和氯甲基聚苯乙烯樹脂反應，共價地掛接在樹脂上。⑵除去該氨基酸的N-末端保護基;⑶第二個氨基酸（氨基被保護）以碳二亞胺為縮合劑，接到第一個氨基酸的氨基上；⑷除去第二個氨基酸的氨基保護基；重復上述步驟，使肽鏈按控制順序從C端向N端延長。合成一個十肽，花費27小時，產率85%。第8頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日肽鏈合成到最后一步時，把樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通入干燥的HBr，使肽與樹脂脫離，同時也切除保護基團。現在多肽合成儀上進行，反應杯中的試劑按程序泵入和除去。第9頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第10頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第11頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第二類實際上在講氨基酸成肽反應時已經講過，從理論上講，該反應在工業上可以用來制備聚氨基酸，但是該反應沒有選擇性。第三類是用酶合成，在水環境下，合成肽需要消耗能量（ATP）；在非水條件下，蛋白酶等水解酶可轉變成合成酶，將氨基酸合成肽。而且不需要消耗ATP。該法優點是條件溫和，步驟少，缺點是氨基酸或肽的溶劑體系選擇以及合成物的卸載。第12頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日近25年來，生物催化劑在非水介質中催化反應以及應用的研究論文呈現爆炸性增長。這里的生物催化劑主要指酶，非水介質包括微水有機溶劑體系；反膠束體系；水-水不互溶兩相體系。在有機介質中，酶改變反應方向，例如水解酶變成合成酶；剛性增加，對底物的專一性大大提高；熱穩定性顯著提高；可重復使用；避免微生物污染；可對水敏感的底物進行催化。非水介質中生物催化簡介第13頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日酶催化的反應氧化還原酶轉移酶第14頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日水解酶裂合酶異構酶合成酶第15頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日酶分子在非水介質中主要以下列形式存在，即：固態-凍干粉或固定化酶或結晶酶；可溶解酶-水溶性大分子修飾酶；非共價修飾的高分子-酶復合物、表面活性劑-酶復合物、乳液酶等；在非水介質中酶能保持整體結構的完整性；其活性部位的結構與在水溶液中相同；非水介質中酶的狀態第16頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日非水介質中的酶學性質非水介質中，酶分子內的氫鍵起主要作用，導致其〝剛性增加〞，維持其活性中心的構象與在水介質中的一致。

第17頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日在非水介質中，酶與介質間的疏水相互作用平衡改變，導致酶的專一性、催化性質等受到影響酶的穩定性提高，例如脂肪酶酶的特異性不變，但是對底物的催化效率會發生變化，即催化效率增加了分配系數項第18頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日微量水的影響是影響非水介質中酶活力及選擇性的控制步驟水的作用：調控酶構象微量水對酶發揮有效催化是必需的，水分子直接或間接參與酶穩定構象的各種非共價作用，弱化荷電基團或極性基團間的相互作用，增加酶柔性及選擇性第19頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日非水介質中酶結合水的位點及結合量離子化基團水化：與酶分子表面的荷電基團結合；結合量0-0.07g/g酶極性水族生長：與酶分子表面極性基團結合；結合量0.07-0.25g/g酶弱吸附：與酶表面弱極性區域結合；結合量0.25-0.38g/g酶完全水化：酶蛋白表面完全水化；結合量0.38g/g酶第20頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第21頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日非水介質中酶催化反應類型及應用酶催化反應的類型C-O鍵的形成，包括酯合成、環氧化、糖苷合成、加氧氧化C-N鍵的反應，包括肽的合成C-C鍵的形成，包括羥醛、酮醛和羥醛轉移、醛縮合、醛加成等還原反應氧化反應，包括C-H、C=C氧化，醇氧化，酚氧化，羧酸氧化，C-N氧化，異構化反應形成C-X的反應（鹵化反應）包括烯烴、炔烴、芳香族及含有活潑的C-H鍵的化合物的鹵化。第22頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日酶非水催化反應的應用⑴制備光學活性化合物⑵合成旋光性高分子⑶糖和類固醇的選擇性催化⑷功能性高分子合成⑸可生物降解高分子的酶促合成第23頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日合成肌肽及其類似物存在于動物肌肉中的肌肽是由β-丙氨酸與L-組氨酸組成的二肽，具有抗氧化、清除自由基，pH緩沖等生理功能。其最顯著的性質是抗氧化，主要表現為捕獲活性氧和自由基，螯合金屬離子，結合脂肪酸氧化產物-醛，是迄今發現的最有效天然抗氧化、抗衰老二肽。第24頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日肌肽及其類似物的結構式第25頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日正丁醇中合成肌肽

40℃、pH6.5，轉化率84.26%第26頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日四氫呋喃中合成肌肽類似物

50℃、pH8.5，轉化率76.35%第27頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第28頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日合成硬脂酰三乙醇銨單酯硬脂酰三乙醇胺鹽酸鹽是一種季銨化合物，在日化行業主要用于洗發香波中，中和頭發蛋白質的負電荷及抗菌。該分子在頭發上的附著力強，產生〝飄逸〞效果，但無光亮。該物質目前采用酸催化劑在140℃左右脫水合成第29頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日用脂肪酶在正己烷中合成，合成溫度55℃，轉化率72.75%，酶可以反復使用多次。

第30頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日合成羥基脯氨酸雙酯羥基脯氨酸（L-Hyp），修飾氨基酸，抗自由基、抗衰老，日化行業在功能性皮膚化妝品中使用。脂/水平衡系數低，不能透過皮膚細胞膜。目前采用兩步法化學合成。單酯合成溫度達120℃，苯系物為帶水劑，雙酯的合成方法未見公開報道。由于其吡咯環的干擾，預計合成溫度將超過160℃，伴隨單酯鍵部分水解。第31頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日合成羥基脯氨酸雙酯

無溶劑、脂肪酶、60℃、6-8h，轉化率超過93%第32頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日酯交換合成單酯第33頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日單酯酯化合成雙酯第34頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第二節蛋白質分子量測定

⒈最小分子量如血紅蛋白含0.335%鐵，其最低分子量=16700⒉滲透壓法π=RT（c/Mτ+Kc2）,Mτ=RT/lim(c0)π/C第35頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第36頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⒊凝膠過濾Ve/Vo=a-blogMτ

式中，Ve為洗脫液體積，Vo為外水體積，Mτ為相對分子質量，a，b為常數。移項得：logMτ=a/b-1/b（Ve//Vo）基于蛋白質主要呈球狀，假設分子量相同，其分子體積及直徑相同。先測幾種標準蛋白質的Ve，以其相對分子質量的對數（logMτ）對Ve作圖，得一條直線。再測樣品的Ve，即可從圖中查出其相對分子量。第37頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第38頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第39頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⒋SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳這是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。基于被分離物質的分子大小和電荷。①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。第40頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日②聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的高聚物，聚合前調節單體濃度比，使之既有適宜的空隙度，又有較好的機械性質。第41頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日③丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交聯劑在水溶液中通過自由基引發的聚合反應形成凝膠。

聚合反應的催化劑包括引發劑和加速劑。引發劑使丙烯酰胺成為自由基，發動聚合反應，加速劑則加快引發劑釋放自由基的速度。④聚丙烯酰胺熱穩定，無色透明，可肉眼觀察或用檢測儀測定。第42頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日常用的引發劑和加速劑的配伍如下表：

引發劑

加速劑（NH4)2S2O8

TEMEDN，N，N，N';四甲基乙二胺

(NH4)2S2O8DMAPNβ－二甲基胺基丙晴核黃素

TEMED第43頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日

用過硫酸銨引發的反應為化學聚合反應；用核黃素引發，需要強光照射反應液，為光聚合反應。聚丙烯酰胺聚合反應受下列因素影響：

1、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止（空氣隔絕）。

2、某些材料如有機玻璃，能抑制聚合反應（選擇容器材質）。

3、某些試劑可以減慢反應速度，如赤血鹽（電位）。

4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢（控溫）。

第44頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日每100mL凝膠溶液中含有單體和交聯劑的總質量數（g）稱凝膠濃度，常用T%表達；凝膠中交聯劑占單體或交聯體質量的百分數稱為交聯度，常用C%表示。此外，聚丙烯酰胺凝膠還有分子篩效應。電泳遷移率與肽鏈分子量的對數有如下關系：logMτ=a-bμR

或logMτ=K1-K2μR式中μR為相對遷移率=樣品遷移距離/前沿（染料）遷移距離，其余為常數。第45頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日測定時，以幾種標準物蛋白質的Mτ的對數值對其μR值作圖，根據待測樣品的μR，從標準曲線上查出它的Mτ。含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，適用于分離1萬至100萬物質，1萬以下的則采用15-30%的凝膠，分子量特別大的采用含4%的凝膠。第46頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種有效的蛋白質變性劑，它能破壞蛋白質的氫鍵和疏水作用。SDS與蛋白質結合使變性蛋白質帶負電荷，覆蓋于多肽鏈上，數量遠遠超過蛋白質所帶電荷。第47頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第48頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日SDS改變了蛋白質單體分子的構象SDS蛋白質復合物呈近似雪茄的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合體直徑（短軸）都是一樣的，約為1.8nm，而長軸長度卻隨蛋白質的相對分子質量成正比例變化。因此，電泳時蛋白質遷移率僅與其分子量相關。第49頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日因此，在電泳時以同樣的電荷/蛋白質比(荷質比）向正極方向移動；消除了蛋白質原有的電荷、分子形狀等因素的影響。第50頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第51頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第52頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第53頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第54頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日常用的電泳方法除了凝膠電泳以外，還有區帶電泳：支持介質為薄膜、紙等；等電聚焦電泳（IEF）：以兩性電解質為電泳介質，將其制備成pH梯度，分離蛋白質等帶電離子的方法。兩性電解質是由多種氨基與羧基比例不同的多氨基多羧酸的混合物構成，例如丙稀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、亞甲基丁二酸等；常用的脂肪胺有乙二胺、二乙烯三胺、乙醇胺等。將上述的酸與胺進行加成反應獲得。第55頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日當被分離的蛋白質到達其等電點區間時，以兼性離子存在，靜電荷為零，既不向正極、也不向負極泳動；等電聚焦電泳分辨率高、可大規模使用，用于分析和工業制備。現在已經有規模化生產的兩性電解質銷售。第56頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第三節蛋白質的鹽溶與鹽析鹽溶：中性鹽對球狀蛋白質的溶解度有顯著影響，在低濃度時，可以增加蛋白質的溶解度，稱鹽溶。鹽溶是蛋白質吸附鹽離子后，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而蛋白質與水之間的作用加強，溶解度增高。第57頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第58頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日鹽析：指蛋白質在高濃度中性鹽存在時從溶液中沉淀析出的現象鹽析時，同濃度二價中性鹽對蛋白質溶解度的影響，要比單價大。中性鹽影響蛋白質溶解度的能力是其離子強度的函數。離子強度定義為：I=1/2∑CiZi2Ci為離子的濃度，Zi為離子的凈電荷第59頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日計算溶液的離子強度，可將各種離子的濃度分別乘以各種離子所帶的凈電荷的平方，然后將所有乘積相加并除以2。例如，2mol/L硫酸銨溶液的離子強度為：［（4×1）+（2×2）］/2=6第60頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日在鹽析時，要加入的硫酸銨可用下式表示：⑴0℃，硫酸銨濃度由飽和度S1增至S2，應向1升溶液中添加的固體硫酸銨克數：W=505（S2-S1）/（1-0.285S2）S1和S2分別表示起始和終了飽和度.飽和度是在給定條件下某中性鹽達到的最大百分濃度；505是0℃時1000mL飽和硫酸銨(100%或1.00飽和度)溶液中所含的硫酸銨克數(505g/1000毫升溶液);⑵將100mL硫酸銨溶液,由飽和度S1

變為S2,應向其中加入飽和硫酸銨的毫升數V:V=100(S2-S1)/(1-S2)第61頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第四節蛋白質的性質一、蛋白質的可解離基團蛋白質分子中可解離基團的pKa值第62頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日二、蛋白質的膠體性質蛋白質分子達到膠體質點的范圍，具有膠體所有的性質，特別是不能通過半透膜。半透膜：能讓水和小分子物質自由通過的膜。蛋白質分子表面分布大量親水側鏈，水溶液中蛋白質分子表面形成一層水膜，吸水量為0.3～0.5克/克蛋白。許多可解離的基團，與周圍相反電荷的離子形成鹽鍵,即雙電層。第63頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第64頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日三、蛋白質的兩性性質和等電點蛋白質分子中的可解離側鏈基團，有的與酸作用，有的與堿作用，是兩性電解質。等電點：某一pH值時，蛋白質所帶正電荷和負電荷相等，即凈電荷為零，此時溶液pH值稱該蛋白質的等電點。第65頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第66頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日等電點時蛋白質分子中可解離側鏈基團的凈電荷為零，雙電層幾乎消失，溶解度最小。等離子點：等電點與介質的離子組成、pH變化有關，故測定等電點要在確定的pH、離子強度的緩沖液中進行。純水中測得的等電點稱等離子點。第67頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日幾種蛋白質的等電點

第68頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質酸性氨基酸和堿性氨基酸含量與等電點的關系第69頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日四、蛋白質變性和復性變性作用：蛋白質受某些物理化學因素的影響，空間構象破壞導致的理化性質，生物學活性改變的現象。變性是蛋白質二級結構以上的高級結構的破壞而導致生物活性喪失的過程。變性因素：強酸、強堿、劇烈攪拌、重金屬鹽、有機溶劑、脲、胍類、超聲波、加熱等。第70頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日變性結果：溶解度降低，不對稱性增加，結晶能力喪失，易被蛋白酶水解。可逆變性：指除去變性因素后，變性蛋白質的空間結構恢復，使生物學活性恢復。不可逆變性：指除去變性因素后，變性蛋白質的空間結構及生物學活性不能恢復。復性：變性蛋白質恢復空間結構及生物學活性的過程。第71頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日五、蛋白質的沉淀水化層和雙電層是蛋白質溶液穩定的兩個主要因素，破壞其中的一個或兩個都可使蛋白質變性而沉淀析出。這種變性蛋白質從溶液中析出的現象稱為蛋白質的沉淀作用。第72頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日1.可逆沉淀：指除去沉淀劑后，使蛋白質恢復溶解狀態。鹽析；鹽析作用破壞雙電層并奪去蛋白質水分。鹽溶；形成雙電層2.不可逆沉淀

重金屬鹽、有機溶劑、生物堿試劑等都能使蛋白質生成不可逆沉淀，不能用透析等方法除去沉淀劑，使蛋白質重新溶解。第73頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑴.重金屬鹽在堿性條件下蛋白質帶負電荷，可與Hg、Pb等重金屬離子結合，形成不溶性的鹽沉淀。

NH2NH2Pr+Hg2+PrCOO-COO-:Hg2+第74頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑵.生物堿試劑生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質。能沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等

第75頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑶.有機溶劑乙醇、丙酮等可破壞蛋白質的水膜，降低溶液的介電常數，使蛋白質分子間的靜電作用增加，而聚集沉淀。介電常數：電荷被真空隔絕時的電勢與被介質隔絕時的電勢之比值。第76頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第77頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日六、蛋白質的沉降作用溶液中的蛋白質在離心力作用下會發生沉降運動，沉降速度與蛋白質分子的大小和密度有關，也與蛋白質分子的形狀、溶劑的密度和粘度有關。在離心場中蛋白質分子受到的凈離心力（離心力—浮力）與摩擦阻力平衡時，單位離心場強度的沉降速度是定值，稱為沉降系數（S表示）。S=1×10-13s。擴散系數：當濃度梯度等于1單位時，在1s內通過1cm2面積而擴散的溶質量。（g/cm2s）以蛋白質的S及擴散系數，可按下式計算蛋白質的相對分子量第78頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日

M=RTS/D（1-νρ）R——氣體常數，R=8.314J/molKT——絕對溫度，KS——沉降系數，SD——擴散系數ν——蛋白質的微分比體積（當加入1克干物質于無限大體積的溶劑中，溶液體積的增量）ρ——溶劑的密度，g/cm3第79頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日七、蛋白質顏色反應第80頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第五節蛋白質分離純化和測定一、蛋白質分離純化的一般原則大多數蛋白質在細胞中都和核酸等生物大分子結合在一起；許多蛋白質在性質、結構上有許多相似，目前，還沒有一種方法能適應多種蛋白質的提取、分離和純化。蛋白質分離純化的基本原則如下：材料：目標物濃度高、新鮮；采用溫和方法處理；盡量避免活性損失。第81頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日1.材料預處理及細胞破碎材料選擇：選擇目標蛋白含量高，容易提取的材料；若要制備有活性的蛋白質，所用材料須新鮮且含量高。⑴材料預處理①丙酮干粉：如果要制備的蛋白質對丙酮不敏感，可制成丙酮干粉（反復用4-8倍體積的冷丙酮脫水），以防止蛋白酶的水解及溫度變化帶來的變性。②冰箱及液氮罐保藏冰箱-20℃，液氮-193℃。可長期保藏。第82頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑵破碎細胞釋放蛋白質破壞細胞的方法有：①機械破碎法；利用機械力的攪切作用破壞細胞壁和細胞膜。高速組織搗碎機，勻漿器，研缽。第83頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日②滲透破碎：利用低滲條件使細胞膨脹而破碎。③凍融法：利用細胞內冰晶破壞膜結構，反復進行多次。但溫度敏感蛋白不用此法。④超聲波法：超聲波使細胞膜受張力不均破裂，超聲波震蕩器。⑤酶法：溶菌酶破壞微生物細胞膜。第84頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第85頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第86頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第87頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日2.蛋白質抽提根據要制備的蛋白質的性質，選擇合適的溶劑將蛋白質與其它組分分開。合適溶劑是指選擇有適宜的pH、離子強度、組成成分等的緩沖液。例如磷酸鹽緩沖液檸檬酸緩沖溶液等。抽提過程中是在低溫下進行的，要注意將溫度控制在4～10℃；提取時需要強化傳質，往往使用攪拌器，但是要注意避免劇烈攪拌或使用過大的剪切力，以防止蛋白變性。第88頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日3.獲得蛋白粗品即從抽提液中獲得初步分離蛋白質，常用的方法有：⑴等電點沉淀法；調節提取液pH，達到目標蛋白的等電點。⑵鹽析法；鹽析分離的蛋白仍保持天然性質并能再度溶解。一般使用中性鹽，例如最常用硫酸銨。但硫酸鈉、磷酸鉀效果最好。第89頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑶有機溶劑沉淀法使用與水可任意互溶的小分子有機溶劑，例如乙醇和丙酮它們從蛋白質分子表面大量奪取水分子，迫使蛋白質通過相反電荷間的吸引力聚集，溶解性降低，進而沉淀下來。調節溶液pH，使其到達蛋白質的等電點附近時再加入有機溶劑，則沉淀效果更好。有機溶劑破壞蛋白質表面的水膜時要放熱，可能導致蛋白質變性，應盡量在低溫下操作并選擇合適的有機溶劑濃度。第90頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日二、分離純化的主要方法用上述方法得到的蛋白質粗品還混有其它蛋白質及非蛋白雜質，須進一步分離純化才能得到可用于醫藥或工業等的產品。常用的純化方法有：⒈離子交換色譜⒉分子排阻色譜⒊親和色譜⒋疏水色譜等常需要聯合使用這些方法才能獲得較高純度的樣品。第91頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日1.分子排阻色譜又稱凝膠過濾法，分子篩色譜。該法使用一種凝膠即交聯葡聚糖，商品名Sephadex。這種物質由水溶性的葡聚糖（Dextran）和環氧氯丙烷交聯而成。控制交聯劑用量，可控制凝膠網格大小，利用網孔大小分離純化蛋白質（體積大，孔外最先流出、小者次之、體積與空相近最后流出。）凝膠過濾分離蛋白質圖第92頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第93頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第94頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第95頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日離子交換纖維素是人工合成的纖維素衍生物，其解離基團可與帶電荷的蛋白質交換達到分離純化。⑴羧甲基纖維素（CM-纖維素）帶羧甲基基團（纖OCH2COOH），是一種陽離子交換劑。在中性pH條件時，羧甲基上的質子可解離下來，與溶液中帶正電荷的蛋白質交換。2.離子交換柱色譜法纖維素顆粒

或瓊脂糖O

CH2CH2

O-

第96頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑵二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素)這是一種陰離子交換劑（纖OCH2CH2N+（C2H5）2，在中性pH條件時，它含有帶正電荷的基團，可與帶負電荷的蛋白質交換。纖維素顆粒

或瓊脂糖H+C2H5

CH2CH2N

C2H5

第97頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日離子交換樹脂第98頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日離子交換樹脂結構第99頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日離子交換原理第100頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第101頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日離子交換器第102頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑶親和色譜據酶與底物專一結合的原理，設計配基，使其能專一與酶結合，再與惰性載體連接，制成親和層析柱。效率特別高。如伴刀豆球蛋白A的純化，伴刀豆球蛋白A對葡萄糖有專一性親和吸附，將葡萄糖連接到瓊脂糖凝膠上，再行純化。CH2CH2CH2被吸附的蛋白質分子瓊脂糖顆粒特異的配體連接臂第103頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日交聯殼聚糖接枝L-Hyp親和吸附樹脂羥脯氨酸（L-Hyp）是合成治療皮膚病、關節炎、腫瘤、減肥及促進傷口愈合等藥物的原料，需求量不斷增加。目前的生產方式：以離子交換樹脂從酸水解膠原蛋白液中分離、洗脫結晶制得。離子交換分離精度低，需多根樹脂柱連續分離才能獲得產品，產生大量含氨基酸的洗脫廢液。第104頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日殼聚糖及其交聯微球制備殼聚糖分子：以氫鍵連接，比表面積小，傳質阻力大，機械強度低交聯殼聚糖微球：席夫鍵連接，布滿微孔，傳質阻力小，適當機械強度。第105頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第106頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第107頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第108頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日親和分離氨基酸對L-Hyp0.58mmol/g，對Pro0.24mmol/g動態吸附交換容量0.58mmol/g，對Gly、Phe、Pro動態交換容量依次為0.09、0.08、0.24mmol/g，基本不交換其它氨基酸，可以一次性獲得以Hyp和Pro兩氨基酸為主的混合物。第109頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第110頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第111頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第112頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日第113頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日⑷高效（壓）液相色譜（HPLC）快速、靈敏、分辨率高、自動化程度高等優點。⑸疏水色譜使用疏水凝膠作分離介質，高濃度鹽情況下，蛋白質疏水性增加，與疏水介質結合。然后逐漸降低鹽濃度，不同蛋白質因疏水性不同依次被洗脫而達到純化目標。第114頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日反膠束萃取蛋白質反膠束(reversemicelles):表面活性劑在有機溶劑中形成的內核含微量水分的納米級球形體。反膠束的形態：球形或近似球形，也有呈柱狀。極性核(polarcore):表面活性劑分子自組裝形成的親水性內環境。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內溶解的水。

第115頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日A

B

第116頁，共128頁，星期日，2025年，2月5日基本性質內水池直徑d：反膠束的大小與溶劑和S的種類與濃度、溫度、I等因素有關，一般為5-20nm，d用下式計算：

Wo水與S的摩爾比，M-水分子質量；asurf-界面面積；N-阿弗加德羅常數。內水的性質：微水相的水分子受S親水基團的強烈束縛,表觀粘度上升50倍,疏水性也極高。隨W0的增大,這些現象逐漸減弱,當W0>16時,微水相的水與正常的水接近,反膠團內可形成雙電層。第117頁