關于酶的催化機理第1頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日提綱一、酶催化機理研究的主要方法二、過渡態穩定學說三、過渡態穩定的化學機制鄰近定向效應廣義的酸堿催化靜電催化金屬催化共價催化底物形變四、幾種常見酶的結構與功能蛋白酶溶菌酶第2頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日酶催化機理研究的主要方法找出保守性的氨基酸殘基三維結構的研究定點突變動力學分析化學修飾計算機模擬第3頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日過渡態穩定學說根據過渡態理論，在任何一個化學反應體系中，反應物需要到達一個特定的高能狀態以后才能發生反應。這種不穩定的高能狀態被稱為過渡態。達到過渡態要求反應物必須含有足夠的能量以克服活化能。1946年Pauling提出，酶與過渡態的親和力要比對基態（底物）的親和力高得多，酶的催化源于其對過渡態的穩定作用。化學反應的過渡態及其前后的自由能變化HA-HB+HC→HA-HB-HC（過渡態）→HB-HC+HA第4頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日“鐵絲酶”催化反應的過渡態穩定機制第5頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日支持過渡態穩定學說的證據根據過渡態的結構設計的過渡態類似物可作為酶的強抑制劑，抑制效果遠高于競爭性抑制劑。利用過渡態類似物作為抗原或半抗原，去免疫動物，由此產生的抗體可能有類似酶的催化作用。第6頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日脯氨酸消旋酶的過渡態及其過渡態類似物抑制劑第7頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日免疫動物產生抗體水解篩選抗體酶可卡因催化可卡因水解的抗體酶的制備第8頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日過渡態穩定的化學機制與酶催化相關聯的過渡態穩定是酶活性中心結構和反應性以及活性中心與結合底物之間的相互作用的必然結果。酶充分使用一系列的化學機制來實現過渡態的穩定并由此加速反應。它們包括：鄰近定向效應廣義的酸堿催化靜電催化金屬催化共價催化底物形變第9頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日鄰近定向效應鄰近定向效應是指兩種或兩種以上的底物（特別是雙底物）同時結合在酶活性中心上，相互靠近（鄰近），并采取正確的空間取向（定向），這樣大大提高了底物的有效濃度，使分子間反應近似分子內反應從而加快了反應速度。底物與活性中心的結合不僅使底物與酶催化基團或其它底物接觸，而且強行“凍結”了底物的某些化學建的平動和轉動，促使它們采取正確的方向，有利于鍵的形成。

第10頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日廣義的酸堿催化廣義的酸堿催化是指水分子以外的分子作為質子供體或受體參與催化，這種機制參與絕大多數酶的催化。蛋白質分子上的某些側鏈基團（如Asp、Glu和His）可以提供質子并將質子轉移到反應的過渡態中間物而達到穩定過渡態的效果。如果一個側鏈基團的pKa值接近7，那么該側鏈基團就可能是最有效的廣義的酸堿催化劑。His殘基的咪唑基就是這樣的基團，因此它作為很多酶的催化殘基。第11頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日廣義的堿催化廣義的酸催化廣義的酸、堿催化第12頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日pH和緩沖溶液濃度對特定酸堿催化和廣義酸堿催化的影響第13頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日溶菌酶Glu35的廣義酸催化第14頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日核糖核酸酶A的廣義酸堿催化第15頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日靜電催化活性中心電荷的分布可用來穩定酶促反應的過渡態，酶使用自身帶電基團去中和一個反應過渡態形成時產生的相反電荷而進行的催化稱為靜電催化。有時，酶通過與底物的靜電作用將底物引入到活性中心。第16頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日溶菌酶Asp52的靜電催化第17頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日Glu35和Asp52分別所起的廣義酸催化和靜電催化，解釋了溶菌酶的活性與pH之間的關系以及它的最適pHpH對溶菌酶活性的影響第18頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日金屬催化近三分之一酶的活性需要金屬離子的存在，這些酶分為兩類，一類為金屬酶，另一類為金屬激活酶。前者含有緊密結合的金屬離子，多數為過渡金屬，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者與溶液中的金屬離子松散地結合，通常是堿金屬或堿土金屬，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+。金屬離子以5種方式參與催化：作為Lewis酸起作用與底物結合，促進底物在反應中正確定向作為親電催化劑，穩定過渡態中間物上的電荷通過價態的可逆變化，作為電子受體或電子供體參與氧化還原反應酶結構的一部分第19頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日碳酸酐酶的金屬催化機制第20頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日共價催化共價催化是指酶在催化過程中必須與底物上的某些基團暫時形成不穩定的共價中間物的一種催化方式。許多氨基酸殘基的側鏈可作為共價催化劑，例如Lys、His、Cys、Asp、Glu、Ser或Thr，此外，一些輔酶或輔基也可以作為共價催化劑，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸吡哆醛。第21頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日幾種酶的共價催化親核共價修飾反應第22頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日乙酰乙酸脫羧酶的親核催化第23頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日磷酸吡哆醛的親電催化第24頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日底物形變底物形變是指當酶與底物相遇時，酶分子誘導底物分子內敏感鍵更加敏感，產生“電子張力”發生形變，比較接近它的過渡態。溶菌酶也利用這種方式進行催化：與溶菌酶活性中心結合的6碳糖在溶菌酶的誘導下，從椅式構象變成半椅式構象而發生形變，周圍的糖苷鍵更容易發生斷裂。第25頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日溶菌酶催化中的底物形變第26頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日蛋白酶的催化機制肽鍵水解在熱力學上是十分有利的，但若無蛋白酶的催化，1個肽鍵在中性pH和25℃條件下約需300~600年的時間才能完成水解。根據活性中心催化基團的性質，蛋白酶可分為四類：（1）絲氨酸蛋白酶——此類蛋白酶的催化基團包括1個不可缺少的Ser殘基，DIFP是它們的不可逆抑制劑；（2）金屬蛋白酶——這類蛋白酶在活性中心結合有金屬離子，其活性絕對需要金屬離子，故金屬離子螯合劑可導致活性的喪失；（3）天冬氨酸蛋白酶——其催化基團包括2個Asp，在偏堿性的pH下無活性；（4）巰基蛋白酶——其催化基團包括1個Cys的巰基，碘代乙酸為它們的不可逆抑制劑。所有蛋白酶在催化中都經歷四面體的過渡態，該過渡態形成的原因是反應涉及一個親核基團進攻肽鍵的羰基碳。若是絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，進攻的親核基團分別是Ser殘基的羥基和Cys殘基的巰基，否則就是水分子。第27頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日絲氨酸蛋白酶這類蛋白酶以一個特定的Ser殘基作為必需的催化基團，屬于該家族成員的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、激肽釋放酶原、凝血酶、纖溶酶等。絲氨酸蛋白酶的催化機制屬于共價催化和廣義酸堿催化的混合體，還有氧陰離子穴對過渡態的穩定，由3個不變的Ser、His和Asp殘基構成的催化三元體起主導作用，這3個氨基酸任何一種突變或修飾均可導致酶活性的喪失。構成催化三元體的3個氨基酸在催化中的具體功能是：Ser195充當進攻底物的親核基團His57作為廣義的酸堿催化劑Asp102的功能僅僅是定向His57，影響His的pKa，改變其酸堿性質。第28頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日胰蛋白酶具有很深的底物結合口袋，口袋的底部又是Asp，特別適合長Lys和Arg的結合；糜蛋白酶的底物結合口袋沒有胰蛋白酶深，但比它寬，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，故特別適合芳香族氨基酸的結合；彈性蛋白酶的底物結合口袋非常淺，最適合結合側鏈較小的氨基酸。第29頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日絲氨酸蛋白酶的催化三元體第30頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日絲氨酸蛋白酶的作用機制多肽底物第31頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日絲氨酸蛋白酶的作用機制第32頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日絲氨酸蛋白酶的作用機制第33頁，共38頁，星期日，2025年，2月5日絲氨酸蛋白酶的作用機制