本文件按照GB/T1.1—2021《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由山東省畜牧協會提出并歸口。本文件起草單位：山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，中英噬菌體工程聯合實驗室，瑞普高科（天津）生物技術有限公司、瑞科盟生物工程有限公司。本文件主要起草人：劉玉慶、胡明、張慶、陳義寶、趙效南、李璐璐、呂強華、劉正潔、趙敏、ThomasSicheritz-Ponten、MarthaClokie、劉愛玲、王友、李培勇、劉長太、吳贊鋒、任慧英、孫虎芝、李克鑫、崔萬超、趙成新、劉曉。本文件為首次發布。畜禽大腸桿菌和沙門菌噬菌體環境改良安全性評價規程本文件規定了畜禽大腸桿菌和沙門菌噬菌體環境改良安全性評價的評價程序、評價內容、綜合判定和實驗室生物安全。本文件適用于畜禽大腸桿菌和沙門菌噬菌體環境改良安全性評價。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定GB/T4789.3食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數GB/T6682分析實驗室用水國家標準GB/T13091飼料中沙門菌的測定GB19489實驗室生物安全通用要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。宿主菌hostbacteria致病性大腸桿菌和沙門菌。3.2裂解性噬菌體lyticphage在短時間內能連續完成吸附、侵入、復制、裝配和裂解五個階段而實現增殖的噬菌體，其基因組不整合入宿主菌的基因組。3.3裂解譜phagelysisspectrum裂解性噬菌體在一定濃度范圍專一裂解致病性大腸桿菌或沙門菌，而不裂解益生菌或其它菌種。3.4噬菌體環境改良phageenvironmentimprovement裂解性噬菌體可以感染特定環境中特異性致病菌，通過寄生在致病性細菌體內進行復制增殖，抑制細菌，對環境起到改良作用。5評價程序特異性特異性6評價內容6.1特異性按附錄A的規定執行。6.2基因組安全特征6.2.1基因組提取按噬菌體基因組（DNA或RNA）提取試劑盒要求提取噬菌體基因組。6.2.2測序與拼接將提取的噬菌體基因組送測序公司進行二代測序，并利用Newblersoftware軟件進行拼接。6.2.3基因注釋使用RAST、Prokka軟件對基因組進行詳細注釋。6.2.4基因組比對使用CARD、VFDB、Phaster軟件比對有無已知的毒素基因、抗藥性基因、整合酶基因和其它可能存在潛在危害的基因。6.3裂解譜/裂解率按附錄B的規定執行。6.4宿主菌殘留6.4.1宿主菌為大腸桿菌時，按照國標GB/T4789.3的規定執行。6.4.2宿主菌株為沙門菌時，按照國標GB/T13091的規定執行。6.5雜菌計數按照GB4789.2規定執行。7綜合判定經檢測全部滿足：為裂解性噬菌體，且無已知的毒素基因、抗藥性基因、整合酶基因和其它可能存在潛在危害的基因；特異性宿主菌為大腸桿菌或沙門菌；對致病性大腸桿菌或沙門菌具有較廣裂解譜，不裂解益生菌；無宿主菌殘留；無雜菌污染。滿足上述所有條件判定為畜禽大腸桿菌和沙門菌噬菌體環境改良安全性合格。8實驗室生物安全開展細菌與噬菌體安全性檢測的實驗室管理應符合GB4789.1、GB19489生物安全要求；廢棄物處理按照GB19489規定執行；細菌和噬菌體管理按照《動物病原微生物菌(毒)種保藏辦理辦法》執行。噬菌體特異性雙層平板法A.1原理噬菌體侵染敏感宿主菌后在宿主菌菌涂布平板上形成的肉眼可見的透明圈。裂解性噬菌體可以形成透明的噬菌斑，在適當條件下，一個噬菌體粒子形成一個噬菌斑，可用于檢出、分離和效價測定。除非另有規定，僅使用分析純試劑。A.2.1水：符合GB/T6682三級。A.2.2胰蛋白胨A.2.3酵母粉A.2.4瓊脂粉A.2.5氯化鈉A.2.6三羥甲基氨基甲烷（Tris）A.2.7硫酸鎂A.2.8氫氧化鈉A.2.9LB液體培養基：稱取胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化鈉10.0g/L置于燒杯中；加入所需水量的2/3于燒杯中，用玻棒攪拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液調pH至7.2～7.4；將溶液倒入量筒中，加水定容至所需體積。121℃高壓滅菌15min備用。A.2.10LB固體培養基：稱取胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，瓊脂粉12.0g/L置于燒杯中；加入所需水量的2/3于燒杯中，加熱并用玻棒攪拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液調pH至7.2～7.4，將溶液倒入量筒中，加水定容至所需體積。121℃高壓滅菌15min備用。A.2.11LB半固體培養基：稱取胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，瓊脂粉6.0g/L置于燒杯中；加入所需水量的2/3于燒杯中，加熱并用玻棒攪拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液調pH至7.2～7.4，將溶液倒入量筒中，加水定容至所需體積。121℃高壓滅菌15min備用。A.2.12SM緩沖液：稱取Tris6.057g/L，NaCl5.8g/L，MgSO4·7H2O2.0g/L置于燒杯中；加入所需水量的2/3于燒杯中，用玻棒攪拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液調pH至7.5，將溶液倒入量筒中，加水定容至所需體積。121℃高壓滅菌15min備用。A.3儀器設備A.3.1電子天平：精度0.1mg。A.3.2電熱恒溫培養箱：精度±0.1℃。A.3.3恒溫震蕩培養箱：精度±0.1℃。A.3.4濾膜：0.22μm，水系。A.4試驗步驟除非另有規定，所有無菌操作均在生物安全柜中進行。A.4.1用LB液體培養基按接種量1%（v/v）培養宿主菌至指數期。A.4.2取噬菌體上清液經0.22μm濾膜過濾，取100μL濾液用SM液進行十倍梯度稀釋，共稀釋10個梯度。A.4.3分別將每個梯度的噬菌體濾液與指數期宿主菌菌液各100μL混合，加入到5mLLB半固體LB瓊脂（0.6％瓊脂）中，顛倒混勻，傾注于預先備好的下層固體瓊脂（1.2％瓊脂，20mLLB，已凝固）平板（9cm直徑）上，均勻鋪平并完全覆蓋底層瓊脂表面，每個梯度重復3次。A.4.4將平板置于37°C恒溫培養箱中倒置培養5h~6h。A.5結果判定觀察雙層平板，若有透明噬菌斑，表明噬菌體能夠特異性裂解宿主菌；若無，表明噬菌體不能特異性裂解宿主菌。A.6注意事項A.6.1雙層平板的下層固體培養基提前傾倒，凝固備用。A.6.2雙層平板的上層半固體培養基冷卻至55°C左右加入噬菌體和宿主菌，以免影響宿主菌生長。噬菌體裂解譜/裂解率測定點斑法B.1原理噬菌體侵染敏感宿主菌后在宿主菌涂布平板上形成的肉眼可見的透明斑。B.2試劑或材料除非另有規定，僅使用分析純試劑。B.2.1水：符合GB/T6682三級。B.2.2胰蛋白胨B.2.3酵母粉B.2.4瓊脂粉B.2.5氯化鈉B.2.6三羥甲基氨基甲烷（Tris）B.2.7硫酸鎂B.2.8氫氧化鈉B.2.9不同O抗原大腸桿菌，見表B.1。表B.1常見不同O抗原大腸桿菌菌株編號O抗原動物來源采集部位菌株編號O抗原動物來源采集部位E1O1雞肝臟E28O78雞肝臟E2O2豬肝臟E29O81鴨心臟E3O3雞肝臟E30O83雞胚E4O4鴨肝臟E31O86鴨肝臟E5O5雞肝臟E32O88雞肝臟E6O8鴨胚E33O96雞肝臟E7O9鴨肝臟E34O98豬肝臟E8O11雞肝臟E35O100雞肺臟E9O15雞肝臟E36O102雞肝臟E10O16鴨肝臟E37O109鴨肝臟E11O17豬肝臟E38O116雞胚E12O18雞墊料E39O119鴨肝臟表B.1常見不同O抗原大腸桿菌（續）菌株編號O抗原動物來源采集部位菌株編號O抗原動物來源采集部位E13O22雞胚E40O121鴨胚E14O23鴨肝臟E41O125雞肝臟E15O24雞肝臟E42O130雞胚E16O25雞肝臟E43O134雞胚E17O29雞肝臟E44O143豬肝臟E18O33鴨胚E45O145鴨肝臟E19O36鴨肝臟E46O153雞肝臟E20O39豬肝臟E47O156鴨肝臟E21O43鴨肝臟E48O157奶牛肝臟E22O45鴨胚E49O166雞肝臟E23O53雞肝臟E50O171豬肝臟E24O54鴨肝臟E51O176雞肝臟E25O63鴨肝臟E52O182雞胚E26O66雞肝臟E53O185鴨肝臟E27O69鴨肝臟B.2.10不同血清型沙門菌，見表B.2。表B.2常見不同血清型沙門菌群1相BS.ParatyphiBbiS.DerbyS.AgonaS.StanleydS.IndianazckS.MbandakaS.NowportrS.BovismorbificansS.KentuckyiS.DublinS.Panama表B.2常見不同血清型沙門菌（續）群1相S.PullorumE1-E2-S.MeleagridisrS.LondonS.AnatumS.SenftenbergG1-G2S.HavanaIS.HvittingfossbKQbS]YS.AustraliaB.2.11益生菌，見表B.3。表B.3常見益生菌種屬屬種乳桿菌屬嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌屬動物雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、乳雙歧桿菌腸球菌屬糞腸球菌、屎腸球菌鏈球菌屬嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌梭菌屬丁酸梭菌B.3儀器設備B.3.1電子天平：精度0.1mg。B.3.2電熱恒溫培養箱：精度±0.1℃。B.3.3恒溫震蕩培養箱：精度±0.1℃。B.3.4濾膜：0.22μm，水系。B.4試驗步驟B.4.1將所有待測菌株按接種量1%（v/v）培養分別培養至指數期。B.4.2各取100μL菌液，分別加入到5mLLB半固體培養基（0.6％瓊脂）中，傾注于預先備好的下層固體瓊脂（1.2％瓊脂，20mLLB，已凝固）平板（9cm直徑）上混合制備雙層平板。B.5.3將待測噬菌體液10倍梯度稀釋3次，每個梯度取2.5μL點于