ICS67.120CCSX04BPMADeterminationoffood-bornestimulantdrugsandprogestinsinmeat—Liquidchromatography-tandemmassspectrometrymethodIT/BPMA30—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所（北京市理化分析測(cè)試中心）提出。本文件由北京預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所（北京市理化分析測(cè)試中心北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：馮月超、劉艷、王建鳳、郭巧珍、姚凱、張晶、林強(qiáng)、李晶晶、蘇東霞。1T/BPMA30—2024本文件描述了畜禽肉中40種食源性興奮劑和5種孕激素含量測(cè)定的液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定方法。本文件適用于畜禽肉中40種食源性興奮劑和5種孕激素含量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4方法原理樣品中的被測(cè)物經(jīng)0.5%乙酸乙腈溶液振蕩提取，加入氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂脫水離心。上清液采用乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、中性氧化鋁和無(wú)水硫酸鎂凈化。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1試劑除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1.1甲醇（CH3OH）：色譜純。5.1.2乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.3無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）。5.1.4氯化鈉（NaCl）。5.1.5冰乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級(jí)純。5.1.6甲酸（HCOOH）：色譜純，純度≥88%。5.1.7乙酸銨（CH3COONH4）：優(yōu)級(jí)純。5.1.8中性氧化鋁（Al2O30.15mm~0.30mm（100~200目層析用。5.1.9提取液：取5mL冰乙酸加入乙腈，并用乙腈定容于1000mL，混勻。5.1.100.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液：稱取0.385g乙酸銨用水溶解，加入1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。5.1.11復(fù)溶溶液：取0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（5.1.10）90mL，加入10mL甲醇混勻。5.1.12標(biāo)準(zhǔn)品：45種被測(cè)化合物和9種內(nèi)標(biāo)物的中英文名稱和CAS號(hào)信息見附錄A，純度≥95%。2T/BPMA30—20245.1.13標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取附錄A中的標(biāo)準(zhǔn)品適量（相當(dāng)于各被測(cè)物的有效成分10mg），精密稱定，分別用甲醇適量使溶解并定容于10mL，配制成濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。-18℃以下避光儲(chǔ)存，其中利尿劑（氨苯喋啶、螺內(nèi)酯、坎利酮）保質(zhì)期為3個(gè)月，其余有效期為6個(gè)月。5.1.14混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：依據(jù)化合物的類別將被測(cè)物分成A~G共7組，見附錄B，其中A-F組為外標(biāo)，G組為內(nèi)標(biāo)。用甲醇配制成7個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制濃度見附錄B。-18℃以下避光儲(chǔ)存3個(gè)月。5.1.15內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：取G組內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成0.1μg/mL~0.4μg/mL的內(nèi)標(biāo)混合中間溶液，見附錄B。5.1.16外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：臨用前分別取上述A~G組混合儲(chǔ)備溶液1.00mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，配制成外標(biāo)混合中間溶液，濃度范圍時(shí)0.1μg/mL~0.4μg/mL，見附錄B。5.1.17溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、0.8mL、1.0mL外標(biāo)混合中間液于10mL容量瓶，均加入0.1mL內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用復(fù)溶溶液（5.1.11）定容至刻度，混勻。5.2材料5.2.1乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）：粒徑40μm~60μm。5.2.2十八烷基鍵合硅膠（C18）：粒徑40μm~60μm。5.2.3凈化管：分別稱取吸附材料PSA（5.2.1）、C18（5.2.2）、中性氧化鋁（5.1.8）各165mg，無(wú)水硫酸鎂（5.1.3）900mg于10mL螺蓋離心管中。5.2.4微孔濾膜：尼龍，0.22μm。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。6.2離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。6.3氮?dú)獯蹈蓛x。6.4超聲波清洗器。6.5多管渦旋混勻儀。6.6渦旋混合器。6.7分析天平：感量0.01g和0.00001g。7試樣制備和保存7.1試樣制備取500g畜禽肉樣品，絞碎均質(zhì)后的供試樣品，作為供試樣品。7.2試樣保存-18℃以下保存。8測(cè)定步驟3T/BPMA30—20248.1樣品的處理8.1.1提取稱取粉碎均質(zhì)后的試樣5.0g（精確至0.01g）于50mL螺蓋離心管中，加入40μL內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.1.15），加入5mL水，渦旋10s后，準(zhǔn)確加入20mL提取液（5.1.9），于多管渦旋混勻儀8000r/min離心5min，上清液待凈化。8.1.2凈化移取上清液10mL于裝入凈化劑的凈化管（5.2.3）中，振蕩10min，8000r/min離心5min。移取上層凈化液5mL于試管中，置于氮?dú)獯蹈蓛x上于45℃以下吹干，加入1.0mL復(fù)溶溶液（5.1.11），渦旋復(fù)溶，用0.22μm微孔濾膜（5.2.4）過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。8.2基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備稱取6份不含被測(cè)物的陰性樣品5.0g（精確至0.01g不加內(nèi)標(biāo)，按照8.1.1和8.1.2的方法提取凈化，吹干，加入1.0mL溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.1.17），渦旋復(fù)溶30s，用微孔濾膜（5.2.4）過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。8.3空白試驗(yàn)除不加試樣外，按8.1中描述的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。8.4儀器分析條件8.4.1液相色譜條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C18反相液相色譜柱（2.1mm×100mm,1.7μm）或等效柱；b)柱溫：30℃;c)進(jìn)樣量：5μL；d)流動(dòng)相：A為甲醇（5.1.1），B為0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（5.1.10）。梯度洗脫條件見表1。表1液相色譜梯度洗脫條件5500558.4.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜參考條件如下：4T/BPMA30—2024a)電離源：電噴霧離子源；b)掃描方式：正離子掃描；c)檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；d)毛細(xì)管電壓：0.5kV；e)離子源溫度：150℃;f)脫溶劑溫度：450℃;g)脫溶劑氣流量：650L/h；h)錐孔氣流量：50L/h；i)碰撞氣體：氬氣；j)45種被測(cè)物及9種內(nèi)標(biāo)物色譜峰的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見附錄C。8.5定性判定在相同試驗(yàn)條件下，試樣溶液譜圖中應(yīng)呈現(xiàn)定量離子對(duì)和定性離子對(duì)的色譜峰，被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比的偏差不超過(guò)表2規(guī)定范圍，則可判斷試樣中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)質(zhì)。表2定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差±20±308.6定量測(cè)定試樣溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（8.2），注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，以被測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測(cè)物峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，做單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性范圍內(nèi)。被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄D。如果有陽(yáng)性檢出應(yīng)采用現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)一步確證。9結(jié)果計(jì)算和表述試樣中各被測(cè)物含量按照式（1）計(jì)算：式中:X——樣品中待測(cè)組分的含量，單位為微克每千克(μg/kg）；c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的被測(cè)物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；vf——加入復(fù)溶溶液的體積，單位為毫升（mLvt——加入提取液的體積，單位為毫升（mL）；5T/BPMA30—2024vj——移取凈化液的體積，單位為毫升（mLm——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；1000——換算系數(shù)。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留一位小數(shù)。10方法準(zhǔn)確度、精密度、檢出限和定量限10.1檢出限和定量限本方法各被測(cè)物的檢出限、定量限見附錄B。10.2準(zhǔn)確度和精密度本方法對(duì)雞肉進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，不同添加水平下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)見附錄E。6T/BPMA30—2024表A.1為被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物中英文名稱和CAS號(hào)。表A.1被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物中英文名稱和CAS號(hào)1C12H18Cl2N2O2C12H18ClNO3bambuterolC18H29N3O54C11H16Cl2N2O5penbuterolC18H29NO26C14H20Cl2N2O7mabuterolC13H18ClF3N2O8brombuterolC12H18Br2N2O9C12H17N3OC11H17NO3C13H21NO3C14H19N3O2ractopamineC18H23NO3C25H37NO4C14H22N2O3propranololC16H21NO2metoprololC15H25NO3C12H11N7C24H32O4SC22H28O3C19H28O2C18H26O2C20H28O2boldenoneC19H26O2C18H22O2C19H26O2prasteroneC19H28O2methyltestosteroneC20H30O27T/BPMA30—2024表A.1被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物中英文名稱和CAS號(hào)（續(xù)）C20H32O2mestanoloneC20H32O2C21H32N2OC22H29FO5hydrocortisoneC21H30O5prednisoloneC21H28O5C21H28O5prednisoneC21H26O5C24H30F2O6C21H29FO5beclomethasoneC22H29ClO5progesteroneC21H30O2C25H32O4medroxyprogesteroneaceC24H34O4C21H30O3C22H30O3C12H9D9Cl2N2O/C18H19D5ClNO3C13H19D3NO3methyltestosterone-C20H27D3O2testosterone-D3C19H25D3O2boldenone-D3C19H23D3O2progesterone-D9C21H21D9O2C21H27D3O5C22H24D5FO58T/BPMA30—2024本方法被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、混合中間溶液分組、配制濃度見表B.1。表B.1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液分組、配制濃度和方法的檢出限、定量限序號(hào)11A21A31A42A51A61A72A81A92A1A1A1A1A1A1A1B1B1B2C2C2C2D2D2D2D2D2D9T/BPMA30—2024表B.1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液分組、配制濃度和方法的檢出限、定量限（續(xù)）儲(chǔ)備液2D2D8D2D2D4E4E4E4E4E4E4E4E2F2F2F2F2F1——G—1——G—1——G—2——G—2——G—2——G—2——G—4——G—4——G—T/BPMA30—2024本方法被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)的參考值見表C.1。表C.1被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)參考值14.78234567894.724.38T/BPMA30—2024表C.1被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)（續(xù)）4.984.612688T/BPMA30—2024表C.1被測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)（續(xù)）88622424.7564.368T/BPMA30—2024