第1節重組DNA技術的基本工具

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。（1）原理：（2）操作水平：（3）操作環境：（4）操作對象：（5）結果：基因重組分子水平生物體外基因賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。什么是基因工程？基因工程理論基礎的分析【問題探究1】為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？（1）DNA的基本組成單位都是

。（2）DNA分子都遵循

配對原則。（3）雙鏈DNA分子的空間結構都是

。【問題探究2】為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？（1）

是控制生物性狀的獨立遺傳單位。（2）遺傳信息的傳遞和表達都遵循

。（3）生物界共用一套

。四種脫氧核苷酸規則的雙螺旋結構基因中心法則遺傳密碼堿基互補

番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？

這些“分子工具”各具有什么特征呢？

到社會中去那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？工具分子手術刀分子縫合針分子運輸車限制性內切核酸酶：DNA連接酶：載體：準確切割DNA分子將DNA片段連接起來

將體外重組好的DNA分子導入受體細胞一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”閱讀教材P71，回答下列問題：

1.限制酶的來源？2.限制酶的特點？3.限制酶的作用部位？4.限制酶的識別序列長度？5.限制酶的切割結果？簡稱限制酶

限制酶是用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例：

E：Escherichia

（屬名）

co：coli

（種加詞）

R：RY13（品系）

I：分離出的第一種限制酶資料卡

限制酶名字的由來EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個字母R型菌株從中分離的第一種限制酶EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一種限制酶。SmaⅠ：粘質沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一種限制酶。流感嗜血桿菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ資料卡

限制酶名字的由來【思考】你能根據所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。3.特點：

4.作用部位:能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。特定部位的磷酸二酯鍵還記得磷酸二酯鍵在哪嗎

1.來源：

主要從原核生物中分離純化出來的

2.種類：

數千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”TACGGCATGCGCAT5′3′5′3′相鄰兩個核苷酸之間的鍵：磷酸二酯鍵CH2

HOHHHHH堿基

磷酸

5’4’3’2’1’脫氧核苷酸5.識別序列長度？大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成；EcoRⅠSmaⅠTaqⅠ5’…T-C-G-A…3’3’…A-G-C-T…5’也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。特點1：都可以找到一條中心軸線；特點2：中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。（1）實例1——EcoRⅠ限制酶切割*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端（2）實例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ識別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端6.切割結果:【練習1】：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一

定不同嗎？

不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G用DNA連接酶連接兩個片段之間的磷酸二酯鍵2025/3/7將兩個雙鏈DNA片段“連接”起來的酶1.概念：二、DNA連接酶——“分子縫合針”2.作用：

3.種類：

（1）E.coliDNA連接酶：來源于大腸桿菌，只連接黏性末端AGTCATTCGATATCGATC兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來。將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

。磷酸二酯鍵3.種類：

（2）T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，既能連接黏性末端，又能連接平末端（但連接平末端的效率相對較低）。*基因工程中通常形成黏性末端類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源

功能只能將具有互補__________

的DNA片段連接起來“縫合”兩種末端，但連接

_________的效率相對較低結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

。大腸桿菌T4噬菌體黏性末端平末端磷酸二酯鍵注意：DNA連接酶沒有識別序列的特異性、只與末端類型有關

【新舊銜接】DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點作用實質作用結果模板相同點催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵催化形成與模板鏈互補的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有互補黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子需要不需要①化學本質都是蛋白質②都是催化形成磷酸二酯鍵與DNA相關的五種酶的比較名稱作用部位作用結果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈練習2：根據所學知識，完成以下填空：

①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④⑤②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵怎樣才能將外源基因送入細胞呢？通常是利用質粒作為載體，將基因送入細胞。為什么不能直接將外源基因送入細胞呢？

游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄并翻譯成蛋白質、游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細胞內復制，隨著細胞分裂，載體會帶著目的基因存在于每個子代細胞中。這樣，基因工程才有意義。質粒:將外源基因送入受體細胞,

在受體細胞內對目的基因進行大量復制。1.作用：動植物病毒:噬菌體:2.種類：質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞將外源基因導入植物細胞將外源基因導入動物細胞動物病毒噬菌體三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”2.最常用的載體——質粒終止子:

轉錄的終點，在轉錄過程中起調控作用。啟動子:

RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的序列復制原點:

DNA復制的起始位點標記基因:便于重組DNA的篩選與鑒定其基因屬于細胞質基因問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？問題2：要使攜帶的外源基因在受體細胞中穩定存在，載體需要具備什么條件？問題3：我們用肉眼看不到載體是否進入受體細胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？條件①：具有一個或多個限制酶切割位點；條件②：能在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制；條件③：具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。條件④：載體DNA必須是安全的，不會對受體細胞有害。【探究】分析歸納載體需要具備的條件抗蟲棉Bt抗蟲蛋白蘇云金桿菌取出轉移通過本節的學習，現在你能描述如何使用這三種工具來獲得抗蟲棉嗎？1.實驗原理DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精DNA能溶于物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下（沸水浴），DNA被二苯胺試劑染成藍色初步分離DNA和蛋白質溶解DNA鑒定DNA00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度四、實驗：DNA的粗提取與鑒定DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。

（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）(1)選材：(2)試劑：①研磨液②體積分數為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現配現用2.材料用具研磨液、二苯胺的配制方法課本P117取材、研磨過濾分離鑒定結果觀察稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨。SDS（十二烷基疏酸鈉）可使蛋白質變性與DNA分離EDTA（乙二胺四乙酸）DNA酶抑制劑，可防止細胞破碎后DNA降解DNATris（三羥甲基氨基甲烷）提供緩沖體系，使DNA在緩沖體系中呈穩定狀態研磨液3.方法步驟

(1)研磨的目的

破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中(2)研磨時間不宜太長

防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量(3)有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶

研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力取材、研磨過濾分離鑒定結果觀察

在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。取材、研磨過濾分離鑒定結果觀察(1)研磨的目的破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中(2)研磨時間不宜太長防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量(3)有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質？

可能含有核蛋白、多糖等雜質②低溫放置幾分鐘的作用

可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；

抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；

低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂；取材、研磨過濾分離鑒定結果觀察

在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%)，靜置2-3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(1)攪拌時應輕緩、并沿一個方向

減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子(2)酒精預冷的作用:

同“低溫放置的作用”取材、研磨過濾分離鑒定結果觀察

取兩支20mL的