第2課時動物細胞融合技術與單克隆抗體[學習目標]1.闡明動物細胞融合技術的概念，舉例說出誘導動物細胞融合的方法。2.概述單克隆抗體的制備過程。一、動物細胞融合技術1．概念：使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。2．原理：細胞膜的流動性。3．誘導融合的方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(PEG融合法,電融合法,滅活病毒誘導法))特別提醒滅活病毒誘導細胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。4．意義：細胞融合技術突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。5．應用(1)成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。(2)用于制造單克隆抗體。判斷正誤(1)與植物原生質體融合相比，動物細胞融合特有的誘導因素有聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒()(2)滅活的含義是用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構()答案(1)×(2)√提示(1)與植物原生質體融合相比，動物細胞融合特有的誘導因素是滅活的病毒。任務一：動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較1．19世紀30年代，科學家曾在患肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中，觀察到多核細胞。如何解釋這一現象？提示病人體內的病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。2．比較動物細胞融合技術和植物體細胞雜交技術(1)原理不同：動物細胞融合的原理是細胞膜的流動性；植物體細胞雜交技術的原理是細胞膜的流動性和植物細胞的全能性。(2)誘導方法不同：兩者都可用聚乙二醇(PEG)融合法和電融合法誘導融合；但動物細胞還可用滅活病毒誘導法誘導細胞融合。(3)最終結果不同：動物細胞融合最終得到的是雜交細胞，而植物體細胞雜交技術最終得到的是雜種植株。1．如圖表示仙臺病毒誘導動物細胞融合的部分過程，下列敘述正確的是()A．細胞A和細胞B必須為同種細胞才能融合B．細胞C同時有細胞A和細胞B的遺傳物質C．該融合過程體現了細胞膜具有選擇透過性D．此過程的原理是動物細胞具有全能性答案B解析不同種的細胞也能融合，如人、鼠細胞融合，A錯誤；如圖所示，細胞A、B融合成一個細胞C，細胞C同時有細胞A和細胞B的遺傳物質，B正確；該融合過程體現了細胞膜具有流動性，C錯誤；此過程的原理是動物細胞膜具有流動性，D錯誤。2．對比動物細胞融合和植物體細胞雜交技術，下列論述合理的是()A．均可使用PEG、電融合或滅活病毒誘導細胞融合B．兩者都可以跨越種屬間的生殖隔離C．兩者都可以體現細胞的全能性D．在適宜的條件下，均可產生完整個體答案B解析滅活病毒是動物細胞融合特有的誘導因素，A錯誤；動物細胞融合和植物體細胞雜交技術都可以打破生殖隔離，B正確；植物體細胞雜交技術體現了細胞的全能性，動物細胞融合技術體現了細胞膜具有流動性，C錯誤；目前，動物細胞融合技術不能產生完整個體，D錯誤。二、單克隆抗體及其應用1．傳統抗體的獲得(1)方法：向動物體內反復注射某種抗原，使動物產生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。(2)缺陷：產量低、純度低、特異性差。2．單克隆抗體的制備(1)大量制備單一抗體的思路(2)存在的問題：B淋巴細胞不可能無限增殖。(3)解決方案(4)制備過程3．單克隆抗體的優點(1)能準確地識別抗原的細微差異。(2)可以與特定抗原發生特異性結合。(3)可以大量制備。4．單克隆抗體的應用(1)用作診斷試劑，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。(2)運載藥物，如ADC(抗體—藥物偶聯物)。(3)直接用于治療疾病。判斷正誤(1)B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合后，得到的都是雜交瘤細胞()(2)單克隆抗體制備過程中兩次篩選的目的相同()(3)ADC的抗體具有靶向運輸作用、藥物具有治療作用()答案(1)×(2)×(3)√提示(1)B淋巴細胞與骨髓瘤細胞如兩兩融合，得到的融合細胞有3種，即B淋巴細胞自身融合細胞、骨髓瘤細胞自身融合細胞和雜交瘤細胞，需要篩選才能得到雜交瘤細胞。(2)單克隆抗體制備過程中第一次篩選是為了篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選是為了獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。任務二：單克隆抗體的制備過程和單克隆抗體的應用1．根據單克隆抗體的制備過程，回答以下問題：(1)給小鼠注射特定抗原的目的是使小鼠產生能分泌特定抗體的B淋巴細胞。(2)B淋巴細胞與骨髓瘤細胞經誘導融合后，培養基中共出現5種細胞。若只考慮兩兩融合，理論上培養基中融合的細胞有3種。體系中出現多種類型細胞的原因是細胞融合是隨機的，且融合率達不到100%。(3)單克隆抗體制備過程中，第一次篩選的目的是篩選出雜交瘤細胞。(4)資料：①細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。②免疫的B淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不能在體外長期存活。③鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖。如果它的D途徑被阻斷的話，它會因不能合成DNA而死亡。根據上述資料可知，第一次篩選的方法是用特定的選擇培養基進行篩選。培養基中加入氨基蝶呤。(5)單克隆抗體制備過程中，第二次篩選的目的是篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。方法是抗體檢測。其原理是抗原—抗體的特異性結合。2．閱讀教材“思考·討論：單克隆抗體的應用”，回答以下問題：(1)ADC的抗體主要發揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發揮治療效應，如殺傷靶細胞。(2)除了細胞毒素，還可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療。一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行腫瘤治療。(3)單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上具有的優勢：單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原發生反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養、冷凍保存和復蘇利用，有利于控制產品的質量和標準化生產診斷試劑盒。ADC在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優點，原因是ADC中的單克隆抗體能將細胞毒素定向帶到癌細胞所在位置，在原位殺死癌細胞，不損傷正常細胞。雜交瘤細胞的抗體檢測和克隆化培養融合后的細胞經特定的選擇培養基篩選培養后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用96孔板培養，使每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞，通過培養讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結合的培養孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續進行有限稀釋，一般需要進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為能產生特定抗體的雜交瘤細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養。3．(2023·北京，12)甲狀旁腺激素(PTH)水平是人類多種疾病的重要診斷指標。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，有關制備過程的敘述不正確的是()A．需要使用動物細胞培養技術B．需要制備用PTH免疫的小鼠C．利用抗原—抗體結合的原理篩選雜交瘤細胞D．篩選能分泌多種抗體的單個雜交瘤細胞答案D解析單克隆抗體制備過程中需要對骨髓瘤細胞等進行培養，即需要使用動物細胞培養技術，A正確；該操作的目的是制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，故應用PTH刺激小鼠，使其產生相應的B淋巴細胞，B正確；抗原與抗體的結合具有特異性，可利用抗原—抗體結合的原理篩選雜交瘤細胞，C正確；由于一個B淋巴細胞經分化形成漿細胞后通常只能產生一種抗體，故篩選出的單個雜交瘤細胞無法分泌多種抗體，D錯誤。4．(多選)將特定藥物與單克隆抗體相結合制成的“生物導彈”，能夠用于殺死人類某些癌細胞，其過程如圖所示。“生物導彈”主要由兩部分組成，一是“瞄準裝置”，二是殺傷性“彈頭”。下列相關敘述正確的是()A．“脾臟中的細胞”是從經免疫處理的實驗動物中獲取的B淋巴細胞B．雜交瘤細胞在培養瓶中培養時會出現接觸抑制的現象C．“瞄準裝置”是指能夠特異性識別癌細胞的單克隆抗體D．構成“彈頭”的抗癌藥物具有選擇性殺傷癌細胞的功能答案AC解析雜交瘤細胞具有骨髓瘤細胞的特點，細胞膜上的糖蛋白等物質減少，可以無限增殖，在培養瓶中培養時不會出現接觸抑制，B錯誤；構成“彈頭”的抗癌藥物沒有特異性，“瞄準裝置”中的單克隆抗體能將藥物帶到特定部位，從而選擇性殺傷癌細胞，D錯誤。課時對點練[分值：100分]第1～7題，每題5分；第8～12題，每題6分，共65分。題組一動物細胞融合技術1．與植物體細胞雜交相比，動物細胞融合的原理及其特有的誘導方法分別是()A．細胞膜的流動性、離心B．細胞膜的流動性、滅活病毒誘導法C．細胞的全能性、電融合法D．細胞的全能性、滅活病毒誘導法答案B解析植物體細胞雜交的原理是細胞膜的流動性、植物細胞的全能性，動物細胞融合的原理是細胞膜的流動性；動物細胞融合常用的方法有PEG融合法、滅活病毒誘導法、電融合法等，其中滅活病毒誘導法是其特有的誘導方法，而PEG融合法、電融合法也可用于誘導植物體細胞雜交。2．下列關于動物細胞融合技術的敘述，錯誤的是()A．細胞融合技術能應用于細胞遺傳、細胞免疫等研究B．動物細胞融合的成功是細胞膜具有流動性的有力證據C．動物細胞融合的基本原理與植物原生質體融合的基本原理不同D．除了化學法和物理法外，動物細胞融合還可以由滅活病毒誘導答案C解析動物細胞融合與植物原生質體融合的原理都是細胞膜的流動性，C錯誤。3．(2024·石家莊高二調研)如圖表示A、B兩種動物細胞融合的一些過程。下列有關說法錯誤的是()A．需要用物理或化學手段使仙臺病毒失去感染能力B．圖中C細胞進行的細胞分裂方式為有絲分裂C．將A、B細胞等量混合誘導得到的融合細胞即為雜交細胞D．動物細胞融合技術為制備單克隆抗體開辟了新的途徑答案C解析若只考慮兩兩融合，將A、B細胞等量混合誘導得到的融合細胞有三種(融合的具有同種核的細胞和雜交細胞)，C錯誤。題組二單克隆抗體及其應用4．下列關于單克隆抗體制備的說法，正確的是()A．將特定抗原注射到小鼠體內，可以從小鼠血清中獲得單克隆抗體B．經特定抗原免疫過的B淋巴細胞在體外培養時可分泌單克隆抗體C．培養雜交瘤細胞必須提供動物血清D．篩選出雜交瘤細胞后，需利用特定抗原再次篩選分泌所需抗體的細胞答案D解析向小鼠體內注射特定的抗原，可以從小鼠血清中獲得抗體，但此時的抗體不是單克隆抗體，A錯誤；經特定抗原免疫過的B淋巴細胞在體外無增殖能力，無法通過培養獲得單克隆抗體，B錯誤；培養雜交瘤細胞可以采用體內培養法和體外培養法，其中體內培養法不需要提供動物血清，C錯誤。5．(2024·南通高二期中)研究表明，髓系細胞觸發受體2(TREM2)是一種免疫抑制受體，在腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用。因此，TREM2抗體藥物有望提高腫瘤免疫療法的療效。如圖為TREM2單克隆抗體的制備流程圖，下列說法正確的是()A．步驟①和步驟⑤分別向小鼠注射TREM2蛋白和分泌TREM2抗體的雜交瘤細胞B．從小鼠脾臟中獲得B細胞，因為脾臟是B細胞產生和成熟的場所C．可將雜交瘤細胞注入小鼠血液中實現單克隆抗體的大規模生產D．步驟③和④的培養孔中均含有TREM2蛋白，依據的原理都是抗原—抗體特異性結合答案A解析B細胞在骨髓中產生和成熟，B錯誤；可將雜交瘤細胞注入小鼠腹腔中實現單克隆抗體的大規模生產，C錯誤；步驟③是用特定的選擇培養基篩選雜交瘤細胞，步驟④的原理是抗原—抗體特異性結合，D錯誤。6．如圖表示抗人體胃癌的單克隆抗體的制備過程，下列有關敘述不正確的是()A．圖中實驗小鼠注射的甲是能與抗人體胃癌抗體特異性結合的抗原B．利用PEG融合法、滅活病毒誘導法和電融合法等均可誘導細胞融合獲得乙C．用特定的選擇培養基對乙篩選，融合細胞均能生長，未融合細胞均不能生長D．丙需進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選后可獲得大量能分泌所需抗體的丁答案C解析選擇培養基只能讓特定的符合條件的細胞存活下來，在題目給定的選擇培養基上，只有雜交瘤細胞才能夠存活，C錯誤。7．(2022·山東，15)如圖所示，將由2種不同的抗原分別制備的單克隆抗體分子，在體外解偶聯后重新偶聯可制備雙特異性抗體，簡稱雙抗。下列說法錯誤的是()A．雙抗可同時與2種抗原結合B．利用雙抗可以將蛋白類藥物運送至靶細胞C．篩選雙抗時需使用制備單克隆抗體時所使用的2種抗原D．同時注射2種抗原可刺激B細胞分化為產雙抗的漿細胞答案D解析根據抗原和抗體發生特異性結合的原理推測，雙抗可同時與2種抗原結合，A正確；根據抗原與抗體能夠發生特異性結合的特性，利用雙抗可以將蛋白類藥物運送至靶細胞，從而使藥物發揮相應的作用，B正確；由于雙抗是在兩種不同的抗原刺激下，B細胞增殖、分化產生不同的漿細胞分泌形成的，因此，篩選雙抗時需使用制備單克隆抗體時所使用的2種抗原來進行抗原—抗體檢測，從而實現對雙抗的篩選，C正確；同時注射2種抗原可刺激B細胞分化形成不同的漿細胞，而不是分化成產雙抗的漿細胞，D錯誤。8．科學家將能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體與藥物結合，制成了抗體—藥物偶聯物(ADC)，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。下列敘述錯誤的是()A．ADC由抗體、接頭和藥物三部分組成B．ADC可與腫瘤細胞表面受體特異性結合C．ADC進入細胞的過程依賴膜的流動性D．單克隆抗體可特異性地殺傷腫瘤細胞答案D解析該單克隆抗體不能殺傷腫瘤細胞，而是與藥物結合，將藥物帶到特定部位，利用藥物殺傷腫瘤細胞，D錯誤。9．(2024·邯鄲高二檢測)為制備抗犬冠狀病毒(CCV，RNA病毒)特異性單克隆抗體，以滅活的CCV為抗原免疫小鼠4次，將提取的小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞用聚乙二醇誘導細胞融合，通過兩次篩選獲得抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞，經克隆化培養，獲得穩定分泌抗CCV單克隆抗體的雜交瘤細胞。下列敘述正確的是()A．免疫小鼠4次的目的是增加小鼠體內的單克隆抗體的量B．實驗中使用的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞在單獨培養時均會出現接觸抑制現象C．誘導后需進行兩次篩選，第一次篩選的目的是篩選出既能無限增殖又能產生所需抗體的雜交瘤細胞D．利用CCV對雜交瘤細胞進行抗體檢測可獲得分泌特定抗體的雜交瘤細胞答案D解析免疫小鼠4次的目的是通過多次免疫，讓小鼠體內產生更多的能產生特異性抗體的B淋巴細胞，A錯誤；骨髓瘤細胞在單獨培養時不會出現接觸抑制現象，B錯誤；誘導后需進行兩次篩選，第一次篩選的目的是篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選的目的是篩選出能產生所需抗體的雜交瘤細胞，C錯誤。10．(多選)(2022·江蘇，19)如圖表示利用細胞融合技術進行基因定位的過程，在人—鼠雜種細胞中人的染色體會以隨機方式丟失，通過分析基因產物進行基因定位。現檢測細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中人的4種酶活性，只有Ⅱ具有芳烴羥化酶活性，只有Ⅲ具有胸苷激酶活性，Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脫氫酶活性。下列相關敘述正確的是()A．加入滅活仙臺病毒的作用是促進細胞融合B．細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為人—人、人—鼠、鼠—鼠融合細胞C．芳烴羥化酶基因位于2號染色體上，乳酸脫氫酶基因位于11號染色體上D．胸苷激酶基因位于17號染色體上，磷酸甘油酸激酶基因位于X染色體上答案ACD解析動物細胞融合過程中，可以利用聚乙二醇或滅活的病毒作誘導劑促進細胞融合，A正確；細胞Ⅲ中保留了人的X、11、17號染色體，故不會是鼠—鼠融合細胞，B錯誤；根據題意和題圖分析可知，芳烴羥化酶基因位于2號染色體上，乳酸脫氫酶基因位于11號染色體上，胸苷激酶基因位于17號染色體上，磷酸甘油酸激酶基因位于X染色體上，C、D正確。11．(多選)如圖是科研人員將藥物與單克隆抗體連接形成的抗體—藥物偶聯物(ADC)的示意圖，它由抗體、接頭和小分子藥物三部分組成，能實現對腫瘤細胞的選擇性殺傷。例如，用于治療乳腺癌的Kadcyla是由曲妥珠單抗和藥物美坦新偶聯的ADC。下列敘述正確的是()A．單克隆抗體由雜交瘤細胞以胞吐方式釋放體現了細胞膜的流動性B．藥物美坦新識別并殺傷乳腺癌細胞體現了抗原—抗體的特異性結合C．ADC中接頭穩定性偏低，會導致藥物分子容易脫落，對正常細胞造成損傷D．ADC設計需要綜合考慮抗體選擇、藥物分子大小及其細胞毒性等問題答案ACD解析藥物美坦新并不具有識別作用，單克隆抗體才具有識別作用，B錯誤。12．(多選)如圖，核苷酸合成有兩個途徑，物質A可以阻斷其中的全合成途徑。正常細胞內含有補救合成途徑所必需的轉化酶和激酶。制備單克隆抗體時選用的骨髓瘤細胞缺乏轉化酶。現用加入H、A、T三種物質的“HAT培養基”來篩選特定的雜交瘤細胞。下列關于篩選原理的敘述，正確的是()A．免疫的B淋巴細胞及其相互融合的細胞因全合成途徑被A阻斷，在HAT培養基上不能增殖B．骨髓瘤細胞及其相互融合的細胞因無法進行上述兩個途徑，而在HAT培養基上不能增殖C．雜交瘤細胞因為可進行補救合成途徑，能在HAT培養基上大量增殖D．HAT培養基上篩選出的所有雜交瘤細胞，既能大量增殖又能產生較高純度的目標抗體答案BC解析免疫的B淋巴細胞及其相互融合的細胞是正常細胞，細胞內含有補救合成途徑所必需的轉化酶和激酶，但因高度分化而不能增殖，A錯誤；骨髓瘤細胞及其相互融合的細胞因骨髓瘤細胞中缺乏轉化酶，無法進行補救合成途徑，而在HAT培養基上不能增殖，B正確；HAT培養基上篩選出的雜交瘤細胞能大量增殖，但并不都能產生高純度的目標抗體，需要進行抗體檢測，篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞，D錯誤。13．(20分)(2024·南京高二調研)為降低乳腺癌治療藥物的副作用，科研人員嘗試在單克隆抗體技術的基礎上，構建抗體—藥物偶聯物(ADC)，過程如圖1所示。請回答下列問題：(1)本實驗中，小鼠注射的特定抗原應取自____________________。(2)步驟②的細胞必須經過步驟③才能篩選得到符合要求的雜交瘤細胞，雜交瘤細胞的特點是_______________________________________________________________________________。雜交瘤細胞可采用注射到小鼠腹腔內培養或進行___________________________________培養的方式進行擴大培養。(3)單克隆抗體的特點是_____________________________________________(至少答出兩點)。(4)步驟④是將獲得的a____________和b________________這兩部分，通過接頭結合在一起，從而獲得ADC。(5)研究發現，ADC在患者體內的作用如圖2所示。①ADC能降低乳腺癌治療藥物的副作用，是因為____________能精確地定位乳腺癌細胞，該過程依賴于_______________________________________________________反應。②ADC進入乳腺癌細胞后，細胞中的溶酶體可將其____