ICS07.080

CCSC04

團體標準

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來源間充質干細胞制備及質量鑒定規范

SpecificationforpreparationandqualityidentificationofIPSCderivedmesenchymal

stemcells

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

中國國際經濟技術合作促進會發布

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來源間充質干細胞制備及質量鑒定規范

1范圍

本文件規定了IPSC來源間充質干細胞的術語和定義、基本要求、制備過程、質量鑒定。

本文件適用于IPSC來源間充質干細胞的制備與質量鑒定。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB3095環境空氣質量標準

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB50073潔凈廠房設計規范

GB50346生物安全實驗室建筑技術規范

GB50591潔凈室施工及驗收規范

3術語和定義、縮略語

術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1.1

誘導多能干細胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人體細胞經重編程而獲得的具有自我更新能力和向三胚層細胞分化潛能的一種干細胞。

3.1.2

凍存cryopreservation

經過程序降溫冷凍，并利用深低溫冷凍儲存技術，以減少細胞代謝活動，保存細胞生物學活性。

3.1.3

復蘇thawing

細胞從脫離生長狀態重新獲得生長活力的過程。

3.1.4

細胞活率cellviability

能夠增值、保持正常代謝活性的細胞占全部細胞的百分比。

縮略語

下列縮略語適用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：誘導多能干細胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

場地與設施

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4.1.1IPSC來源間充質干細胞制備機構選址應符合《藥品生產質量管理規范》要求，空氣質量標準應

符合GB3095標準分級二級標準。

4.1.2IPSC來源間充質干細胞制備機構實驗室或廠房應由具有潔凈實驗室設計建設資質的工程公司

設計與建造，并應符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規定。建設完成后，各功能區域

的潔凈級別應由專業機構進行檢測并出具合格證明。

4.1.3干細胞制備功能區應按IPSC來源間充質干細胞制備工藝進行各區域設計，符合《藥品生產質量

管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》要求。干細胞制備機構應配備獨立質量檢

測實驗室，并符合GB19489和GB50346的規定。

設備和耗材

4.2.1IPSC來源間充質干細胞的制備機構應優先選用符合《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑

質量控制及臨床前研究指導原則》要求，獲得國家資質認證的設備、儀器、耗材和試劑。

4.2.2IPSC來源間充質干細胞的制備機構應對設備、儀器、耗材和試劑供應商進行資質審核認證，要

求供應商提供產品質量報告和批次檢驗報告，并對耗材及試劑進行質量抽檢，避免采購質量不合格的產

品。

4.2.3IPSC來源間充質干細胞的制備機構設備和儀器正式使用前應做安裝確認(IQ)、運行確認（OQ）

和性能確認(PQ)，并定期進行第三方校準，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細胞制品。

4.2.4IPSC來源間充質干細胞的制備機構應對設備與儀器進行編號建檔，并建立標準操作流程(SOP)，

確保使用、運行、保養、維修記錄完整可追溯，對于關鍵工藝相關設備參數應進行實時監測，及時對狀

態異常的設備進行校對和維修。

人員管理

4.3.1IPSC來源間充質干細胞制備機構應分別設立干細胞制備負責人、質量管理負責人和質量授權人

崗位。由法人授權任命，任職資質應符合《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨床前

研究指導原則》要求，定期接受崗位專業培訓，制備技術負責人與質量管理負責人、質量授權人不得相

互兼任。

4.3.2IPSC來源間充質干細胞制備和質控技術人員應具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的

抗體檢測應為陰性，并且(矯正)視力正常，無色盲、色弱。

4.3.3IPSC來源間充質干細胞制備和質控技術人員應半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發熱等疾病

狀態下不得進入潔凈操作區，需完全康復后方可恢復崗位操作。

4.3.4IPSC來源間充質干細胞制備和質控技術人員上崗前應經過專業培訓，內容包括但不限于干細胞

理論與實踐、生命倫理、干細胞法律法規、GMP管理、GCP資質、制劑基本知識、細胞培養基礎、生物

安全、儀器設備使用與維護方法、物料管理與清潔衛生、崗位職責、操作規范等內容。

5制備過程

樣本采集

5.1.1基本原則

5.1.1.1樣本采集與處理應符合GB/T37864的要求。

5.1.1.2采集和處理程序可供樣本采集人員使用。

5.1.1.3應具備相關的資質和設施環境。

5.1.1.4應通過倫理審查批準并履行知情同意程序。

5.1.1.5應建立適當的質量管理體系確保符合用戶需求并持續改進。

5.1.2供者健康

5.1.2.1間充質干細胞采集制備方應對干細胞供者的基本信息與健康信息進行詳細采集與記錄，同時

做好對供者的隱私保護，相關記錄入檔保留至少30年。

5.1.2.2干細胞供者應無血液系統疾病、內分泌系統疾病、惡性腫瘤史、性傳播疾病及高危人群史、

吸毒史，不應具有包括但不限于以下疾病或健康狀況：

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a)一般傳染性疾病或其他遺傳疾病：HIV、HBV、HCV、梅毒、HTLV、EBV與CMV抗體與核酸檢測

應為陰性；

b)傳染性皮膚病(未治愈的)；

c)大面積皮膚損傷(未治愈的)；

d)鼻/咽喉傳染病(未治愈的)。

e)采集前12個小時內用過酒精，鎮靜藥等。

5.1.3采集場所

采集場所應達到Ⅲ級潔凈手術室要求。

5.1.4采集人員

采集人員應具有醫師職業證，且經過相應的技術培訓。

5.1.5采集流程

5.1.5.1采集人員應按照要求填寫個人信息，個人信息表應包括但不限于：姓名、性別、有效身份證

件、聯系方式、緊急聯絡人、住址等。

5.1.5.2采集人員在采集前填寫健康調查表。

5.1.5.3樣本采集過程應采取措施保護供者的健康和安全，并通過無菌技術最大限度降低污染、感染

和病原傳播的風險。采集用的接觸采集物的試劑和物料應無菌、符合臨床安全標準，且在有效期內使用。

分離與培養

5.2.1選取的成年細胞在細胞培養基中進行培養，以確保它們的生長和健康狀態

5.2.2取組織細胞進行STR檢測。

5.2.3可采用組織貼塊法或酶消化法等方法分離間充質干細胞，分離方法應經過驗證。

5.2.4培養需符合無菌操作要求，保證無外源微生物污染。

病毒載體傳遞和細胞轉化

使用病毒載體來引導誘導因子進入成年細胞中。這些誘導因子通常包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc

等。成年細胞在誘導因子的作用下開始重編程。

細胞傳代

5.4.1IPSC來源間充質干細胞傳代操作應嚴格遵照《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控

制及臨床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染，相關操作均進行記錄并入檔保存至少30年。

5.4.2IPSC來源間充質干細胞一般情況在達到80%～90%融合度可進行傳代操作，傳代操作應密度適

宜、及時，迅速。

5.4.3傳代所使用消化酶應符合IPSC來源間充質干細胞分離與培養的基本要求，盡量采用國家已批

準的臨床級產品。如必須使用動物源性消化酶，應確保其無特定動物源性病毒污染。

細胞凍存

5.5.1IPSC來源間充質干細胞凍存操作應嚴格遵照《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控

制及臨床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染，相關操作均進行記錄并入檔保存至少30年。

5.5.2經制備數量達到凍存要求的IPSC來源間充質干細胞系可進行凍存操作，凍存細胞應加入適當

的凍存保護液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進行保存。

5.5.3凍存液成分應符合IPSC來源間充質干細胞分離與培養的基本要求，盡量采用國家已批準的臨

床級產品或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過10%，如必須使用動物源性血清，應確保其無特定動物

源性病毒污染，嚴禁使用海綿狀腦病流行區來源的牛血清。

5.5.4凍存細胞應標明干細胞名稱、培養條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯

一標識。

5.5.5液氮凍存應使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負責，保證液氮充足，溫度恒定。

細胞復蘇

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5.6.1將凍存管從冷凍罐中取出后，盡快放入37℃～42℃水浴鍋中，輕搖凍存管使其內容物在3min

內融化。用75%酒精擦拭凍存管外部后，將其移入無菌操作臺內。

5.6.2將干細胞懸液轉移至含有培養基的離心管中進行離心，去除冷凍保護劑。離心后用完全培養基

重懸干細胞，并將細胞按密度接種于培養瓶中，放入CO2培養箱培養。

5.6.3復蘇后細胞的活率應不低于75%。復蘇后細胞的接種密度應適宜。

制劑制備

5.7.1復蘇檢測合格的工作庫細胞，按規定的接種密度進行接種、培養；融合度達到70%～90%時，按

規定的制劑類型制備成IPSC來源間充質干細胞制劑。

5.7.2按制劑質量標準進行檢驗，檢驗合格后進行制劑放行。

6質量鑒定

鑒定內容

6.1.1間充質干細胞安全性

6.1.1.1微生物檢測

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1101無菌檢測法執行，對間充質干細胞樣本采集、

運輸、分離、培養、凍存、復蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存液等）

檢測。細菌和真菌檢測結果都應為陰性。

6.1.1.2支原體檢測

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3301支原體檢測法執行，對間充質干細胞樣本采集、

運輸、分離、培養、凍存、復蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存液等）

檢測。支原體檢測結果都應為陰性。

6.1.1.3細胞內外源致病因子檢測

采用血清ELISA檢測法或核酸檢測法，對間充質干細胞樣本采集、運輸、分離、培養、凍存、復蘇

等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存液、細胞等）檢測。HIV抗體、HBsAg、

HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測應為陰性；HCV、HBV、HIV病

毒核酸檢測應為陰性。

6.1.1.4內毒素檢測

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1143細菌內毒素檢測法執行，對間充質干細胞樣本

采集、運輸、分離、培養、凍存、復蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存

液等）檢測。各類樣本中的內毒素檢測值應≤0.5EU/mL。

6.1.1.5異常免疫學反應檢測

采用流式細胞術以及ELISA技術測定間充質干細胞對于活化的人總淋巴細胞的增殖和對不同淋巴

細胞亞群增殖能力的影響，以及對淋巴細胞相關細胞因子分泌的影響。淋巴細胞亞群應無異常增殖，細

胞因子表達水平應無異常增加。

6.1.1.6致瘤性檢測

采用免疫缺陷動物（裸鼠或SCID鼠），通過局部或靜脈方式接種間充質干細胞，評價間充質干細胞

致瘤性。體內致瘤試驗嚴格遵照動物倫理要求執行，單只小鼠接種間充質干細胞數量≥106細胞/kg，觀

察期≥12周。間充質干細胞應無致瘤性。

6.1.2間充質干細胞穩定性

6.1.2.1細胞數量和活率檢測

選用血球細胞計數板或細胞計數儀進行細胞計數，將待檢測細胞使用臺盼藍或A0/PI熒光染料染

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色，讀取細胞數并計算活率。各代數及批次間充質干細胞活細胞比例≥90%。

6.1.2.2生長活性檢測

通過檢測細胞倍增時間、細胞周期、克隆形成率以及端粒酶活性對間充質干細胞生長活性進行測定，

各代數及批次間充質干細胞應處于指數生長期，GO期細胞數≤10%，具有端粒酶活性。

6.1.2.3細胞純度和均一性檢測

采用間充質干細胞表面標志物流式檢測以及人基因組DNA短片段重復序列(STR)測序進行檢定。各

代數及批次間充質干細胞表面標志物表達應符合流式檢測比例要求，單一細胞系的間充質干細胞各代

次及批次細胞STR檢測結果應保持一致。

6.1.3間充質干細胞生物學特征

6.1.3.1細胞形態檢測

顯微鏡下觀察，間充質干細胞貼壁生長，呈梭形或星狀外觀，形態均一。

6.1.3.2細胞表面標志物檢測

采用流式細胞術進行測定，間充質干細胞表面標志物CD73、CD90、CD105陽性率不低于95%；CD14、

CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率不高于5%。

6.1.3.3染色體核型檢測

采用G帶分析法進行測定，間充質干細胞染色體數量為46(含XX/XY)，無染色體缺失、異位和重排現

象。

6.1.3.4免疫調節功能檢測

采用ELISA技術和流式細胞術測定經炎癥因子(IFN-γ與TNF-α)誘導后間充質干細胞中吲哚胺2，

3-雙加氧酶(IDO)的表達和功能，以及對于活化的人總淋巴細胞的增殖和對不同淋巴細胞亞群增殖能力

的影響。間充質干細胞經誘導應表達IDO，并可抑制人淋巴細胞增殖。

檢驗分類

6.2.1批次質量檢驗

IPSC來源間充質干細胞制備機構應對同一生產周期、同一生產線、同一來源、同一代次