PAGEPAGE115食品微生物檢驗技術實驗技術實驗1食品中細菌菌落總數的測定1目的要求（1）掌握食品中菌落總數測定方法。（2）了解食品清潔程度（被污染程度）及觀察細菌在食品中繁殖的動態，從而為被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。2基本原理菌落（colony）是指細菌在某一種固體培養基上克隆增殖發育成肉眼可見的細菌集團。菌落總數是指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后（如培養成分，培養溫度和時間、pH、需氧性質等），所得1mL（g，cm2)檢樣中所含菌落總數。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colonyforningunit。菌落總數是作為判定食品的清潔程度（被污染程度）的標記，通常越干凈的食品，單位樣品菌落總數越低。反之，菌落總數就越高。菌落總數的測定是以每個活細菌能克隆增殖形成一個可見的單獨菌落為基礎的，但是在實踐中除了單個細胞形成菌落外，二個或兩個以上相連的同種細胞也同樣可形成菌落，所以現在均以菌落總數（而不是活細菌數）或菌落形成單位數表達。由于菌落總數的測定是在37℃有氧條件下培養的結果，對于厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜熱菌在此條件下不生長，有特殊營養要求的細菌也受到限制。因此，這種方法所得到的結果，實際上只包括一群在普通營養瓊脂中發育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細菌菌落的總數。但由于在自然界這類細菌占大多數，其數量的多少能反映出樣品中細菌的總數，正因為如此，用該方法來測定食品中含有的細菌總數已得到了廣泛的認可。4848+2h36+1檢樣做成幾個適當倍數的稀釋液選擇2～3個適宜稀釋度，各以1ml量加入滅菌平皿內每皿內加入適量營養瓊脂菌落計數結果圖10-1菌落總數實驗程序3實驗材料3．1儀器恒溫箱、冰箱、恒溫水浴鍋、天平、微波爐、均質器。3．2材料吸管（容量為0.1mL、1m和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、滅菌平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、滅菌鑷子。3．3試劑營養瓊脂培養基、75%乙醇、0.85%生理鹽水。4實驗方法與步驟4．1菌落總數實驗程序（如圖10-1）4．2檢樣稀釋及培養（1）以無菌操作將檢樣25g(25mL)剪碎放于裝有225mL滅菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶內，經過充分振蕩或均質處理制作成1：10的均勻稀釋液（固體食品有的需先用滅菌研缽研磨后再稀釋）。（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液），振搖試管混合均勻，作成1：100稀釋液，按上述操作順序，作10倍系列稀釋液，每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。（3）根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋液，分別在作10倍遞增稀釋同時，吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。（4）稀釋液移入平皿后，應及時將融化并冷卻到46℃營養瓊脂培養基注入平皿約15mL，并轉動平皿使其混合均勻，同時將營養瓊脂培養基注入加有無菌生理鹽水的滅菌平皿內作空白對照。（5）待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36+1℃溫箱內培養24+2hr（肉、乳和蛋品為48+2h，水產為30℃48+2h）。4．3菌落計數將培養48h后的平板取出，選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數測定標準，一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板的平均數，乘以稀釋倍數，即得每克（或毫升）樣品所含菌落總數。4．4平板菌落計數方法(1)平板菌落數的選擇選取菌落數在30～300個之間的平板作為菌落總數測定的標準，且一個稀釋度應使用兩個平板的平均數。其中當一個平板有較大片狀菌落生長時，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。(2)稀釋度的選擇A．應選擇平均菌落數在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。B．若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30～300個之間，則4個數相加之和除以(2+2×0.1)乘以稀釋倍數報告之。3個數在30-300之間,則3個數相加除以(1+2×0.1)或(2+1×0.1)乘以稀釋倍數報告之。C．若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。D．若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最底的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。E．若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于<1乘以最低稀釋倍數報告之。F．若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。(3)菌落數的報告菌落數在100以內時，按其實有數報告，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，以四舍五入方法計算，為了縮短數字后面的零數，也可用10的指數來表示。(見表28-1)表10-1稀釋度選擇及菌落數報告方式例次稀釋液及菌落數菌落總數（cfu/g，mL）報告方式（cfu/g，mL）10-110-210-31多不可計1642016400016000或1.6×1042多不可計295463100031000或3.1×1043多不可計2716030909300000或3.0×1044多不可計多不可計313313000310000或3.1×105527115270270或2.7×1026000<1×10<107多不可計305123050031000或3.1×1045實驗結果（1）將實驗得到的菌落總數結果記入下表10-210-310-410-5備注12平均（2）報告所選兩個稀釋度之比及檢測結果。6注意事項（1）若實驗樣品為食品，為防止食品碎屑混入瓊脂影響計數，通常需在瓊脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培養后，如系食品顆粒，不見變化，如為細菌，則生成紅色菌落。（2）理論上講，為了得到實驗食品中所有細菌菌落總數，應將樣品接種到幾種不同的培養基中并培養在不同的條件下，所得到的細菌菌落數總和。但根據國家頒發的不同食品的規定，都是根據用普通營養瓊脂，37℃（水產品30℃）進行需氧培養的結果來確定的，而且這種測定確具代表性，因而菌落總數在一般衛生學評價中并不要求用不同培養基進行選擇性培養。（3）目前還有幾種快速檢測菌落總數的方法如由軍事醫學科學院研制而成食品細菌檢驗箱，菌落總數測定采用試管斜面計數法操作簡便，不易受污染，結果與國標法平板計數一致。另一種是3M有限公司提供的PetrifilmPlates測試片（菌落總數測試片）。由于測試片中含有一種紅色指示劑，使所有菌落易于識別計數，該片也可用于乳酸菌測定，48hr可確定菌落總數。7思考題（1）什么是菌落總數，何謂cfu？（2）若平板上菌落數生長一半較均勻，另一半呈片生長，如何計數菌落數？（3）影響雜菌總數準確性的因素有哪些？

實驗2食品中大腸菌群的測定1目的要求（1）學習與掌握食品中大腸菌群的測定方法。（2）了解大腸菌群在食品衛生學檢驗中的意義。2基本原理大腸菌群系指一群在37℃24hr能發酵乳糖產酸產氣，需氧或兼性厭氧的埃希氏無芽孢桿菌。它包括大腸埃希氏桿菌和檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌等類大腸桿菌。大腸菌群的檢測就是根據大腸菌群的定義，即利用它們能發酵乳糖產酸產氣的特性而設計的初發酵實驗；初發酵陽性管通過BGLB進行復發酵證實。根據證實為大腸菌群陽性管數，查MPN檢索表，報告每mL（g）大腸菌群的最可能數（食品中大腸菌群系以每mL（g）檢樣內大腸菌群最可能數MPN表示），MPN最可能數是表示樣品中活菌密度的估計。3實驗材料3．1儀器溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、微波爐、均質器、普通光學顯微鏡。3．2材料吸管（0.1mL、1mL和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、鑷子、小倒管等。3．3培養基LST肉湯，BGLB肉湯革蘭氏染色液，0.85%生理鹽水。4實驗方法與步驟4．1大腸菌群檢驗程序（如圖20-1）GB/T4789.3-2003圖20-1大腸菌群檢驗程序檢樣25g檢樣25g或25mL稀釋液225mL1:10稀釋均質3個稀釋度,接種LST肉湯(36+1℃,48+2不產氣大腸菌群陰性報告產氣BGLB(36+1℃,48+↓(24+2h,36+1℃產氣不產氣大腸桿菌陽性報告大腸菌群陰性能ntg性報告大腸菌群陰性大腸菌群陰性4．2檢樣稀釋取檢樣25g(mL)剪碎，以225mL滅菌生理鹽水稀釋做成1:10稀釋液，并依次做10倍遞增稀釋液，例如10-1，10-2，10-3，10-4等，估計樣品污染程度，選擇3個合適稀釋液備用。4．3乳糖發酵試驗將待稀釋檢樣品接種LST肉湯內，接種量在1mL以上者，用雙料LST肉湯管，1mL及1mL以下者，用單料LST肉湯管，每一稀釋度接種3管，共種3個稀釋度,置36+1℃溫箱內培養48+2h，如所有LST肉湯管都不產氣，可報告為大腸菌群陰性。如有產氣者，則按下列程序進行。4．4復發酵證實試驗用吸管吸取1mLLST肉湯內管接種到BGLB肉湯內，36+1℃溫箱內48h培養，觀察有無產氣，不產氣,報告陰性,產氣可報告陽性作大腸菌群計數4．4大腸菌群最可能數的(MPN)報告按證實的LST陽性管數查檢索(MPN)表報告每g或每mL中大腸菌群MPN值.5實驗結果（1）將大腸菌群檢驗結果填入下表接種量管號發酵反應結果有無典型菌落革蘭氏染色結果復發酵反應結果最后結論+或-1mL1230.1mL1230.01mL123（2）根據證實為大腸菌群的陽性管數，查（MPN檢索表后報告每100mL(g)大腸菌群的最可能數。6注意事項雙料乳糖發酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖發酵管專供醬油及醬類檢驗用，3mL乳糖發酵管供大腸菌群證實試驗用。（1）初發酵實驗與證實實驗有時不一定符合。凡初發酵的產氣管一定要做伊紅美蘭平板分離。如果平板出現典型的大腸菌菌落，G-染色陰性無芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，應多挑取菌落包括挑菌落中心黑紅、灰紅，以及紅、粉紅等菌落，在革蘭氏染色的同時，做證實試驗，以免出現假陰性。（2）關于產氣發酵管內的小倒管如儲留氣體則是陽性結果，如果不存留氣體，但液面及管壁可以看到緩慢上浮的小氣泡，或者對沒有氣體產生的發酵管用手輕輕彈動試管，有氣泡出現而且沿管壁上升，都應考慮可能是由菌發酵產生氣體的緣故。應做進一步觀察，因為這種情況陽性檢出率可達50%以上。（3）所謂典型大腸埃希氏菌是指具有該菌所有生物學特性的大腸菌。新近隨糞便排出的大腸菌多屬于這一類型。所以如查出多量典型大腸埃希氏菌表明樣品是糞便的近期污染結果。研究表明，典型大腸菌隨糞便排到外界環境中約一周后，典型菌可變為非典型菌。這種變化以生化變異為主。如果樣品檢測以非典型大腸菌為主，則指示樣品受糞便的遠期污染。大腸埃希氏菌大量存在于人畜腸道，并隨糞便排出。本菌在糞便中數量多，易于培養，對外界的抵抗力與腸道致病菌比較相近，所以選擇大腸埃希氏菌作為被糞便污染的指示菌，合理、科學。凡被糞便污染的樣品，就有可能受到致病菌污染。所以大腸菌群的測定是必做的食品衛生學檢項目。（4）大腸菌群檢驗方法（國標）采用的管發酵通常需三天，目前已開發出幾種快速檢驗方法（TTC顯色法，DC試管法，紙片法）。如由軍事醫學科學研究院研制而成的一小時快速檢測法，檢驗結果與國標法一致。3M中國有限公司提供的petrifilmplates測試片，可在２４小時確定大腸菌群數。7思考題（1）什么是大腸菌群？大腸菌群表示的單位及其意義。（2）固體檢樣三個稀釋度檢測結果都是陰性時，MPN怎樣表示？（3）液體檢樣三個稀釋度檢測結果都是陰性時，MPN怎樣表示？（4）大腸菌群檢驗中為什么首先要用乳糖膽鹽發酵管發酵？

實驗3食品中沙門氏菌屬的檢驗1目的要求（1）學習食品中沙門氏菌屬的檢驗方法和基本原理。（2）熟悉沙門氏菌屬因子血清的使用方法。（3）了解沙門氏菌屬的生化反應及基本原理。2基本原理沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類和動物發病及食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙門氏菌的含量較少，且常由于食品加工過程使其受到損傷而處于瀕死的狀態。為了分離與檢測食品中的沙門氏菌，對某些加工食品必須經過前增菌處理，用無選擇性的培養基使處于頻死狀態的沙門氏菌恢復其活力，再進行選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖而大多數的其它細菌受到抑制，然后再進行分離鑒定。沙門氏菌屬是一群血清學上相關的需氧，無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，周身鞭毛，能運動，不發酵側金盞花醇、乳糖及蔗糖，不液化明膠，不產生靛基質，不分解尿素，能有規律地發酵葡萄糖并產生氣體。沙門氏菌屬細菌由于不發酵乳糖，能在各種選擇性培養基上生成特殊形態的菌落。大腸桿菌由于發酵乳糖產酸而出現與沙門氏菌形態特征不同的菌落，如在SS瓊脂平板上使中性紅指示劑變紅，菌落呈紅色，借此可把沙門氏菌同大腸桿菌相區別。根據沙門氏菌屬的生化特征，借助于三糖鐵、靛基質，尿素、KCN，賴氨酸等試驗可與腸道其它菌屬相鑒別。本菌屬的所有菌種均有特殊的抗原結構，借此也可以把它們分辨出來。3實驗材料3．1設備和材料天平、均質器或研缽、培養箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌三角燒瓶、滅菌吸管（l0mL）、滅菌平皿、滅菌小玻管、滅菌毛細吸管、橡皮乳頭、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架等。3．2培養基和試劑緩沖蛋白胨水(BP)，氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液，四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，亞硫酸鉍瓊脂(BS)，DHL瓊脂，HE瓊脂，SS瓊脂，三鐵糖瓊脂(TSI)，蛋白胨水，靛基質試劑，pH7.2尿素瓊脂，KCN培養基，氨基酸脫羧酶試驗培養基，糖發酵管，ONPG培養基，半固體瓊脂，緩沖葡萄糖蛋白胨水(附MR、V·P試劑)，丙二酸鈉培養基，氧化酶試劑，革蘭氏染色液，26種(初步分型)、57種(一般分型)、144種(詳細分型)沙門氏菌因子血清。4實驗方法與步驟4．1沙門氏菌屬檢驗程序（如圖32-1）一般4h，干蛋品18一般4h，干蛋品18～24h36±１18～24h40～48h18～24h18～24h36±1℃18～24h36±118～24h424236±１檢樣前增菌法：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品25g＋BP225ml直接增菌法：鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經加工的食品25g＋滅菌生理鹽水225ml，做成檢液勻液1ml勻檢樣＋10mlTTB1ml勻檢樣＋10mlSC+SC100ml;1m10mlTTBBSDHL(或HE、WS、SS)挑取可疑菌落TSI（斜面、底面、產氣、H2S），蛋白胨水（靛基質），尿素（pH7.2），KCN，賴氨酸營養瓊脂H2S+，靛基質－尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S+，靛基質＋尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S－，靛基質－尿素－，KCN－賴氨酸＋/－非如左述的各種反應結果甘露醇+、山梨醇+ONPG非沙門氏菌沙門氏菌血清學試驗非沙門氏菌報告25g樣品中檢出或未檢出沙門氏菌1ml勻檢樣＋10mlSC（或TTB）100ml沙門氏菌屬檢驗程序圖32-1圖32-1沙門氏菌屬檢驗程序營養瓊脂表32-1沙門氏菌屬各亞屬在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ亞屬Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸瓊脂產H2S菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色、菌落周圍培養基可呈黑色或棕色；有些菌株不產生H2S，形成灰綠色的菌落，周圍培養基不變色。黑色有金屬光澤。DHL瓊脂無色半透明，產生H2S菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同，乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數菌株產H2S，菌落中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍綠色或藍色，中心黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂無色透明，產生H2S菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養基明顯。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時與大腸埃希氏菌不能區別。4．2前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品均應經過前增菌。各稱取樣品25g，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶內，固體食品可用均質器，8000～10000rpm/min打碎lmin，或用研缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化。于36±1℃培養4h(干蛋品需培養18～24h)，移取10mL轉種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或硫磺酸鈉煌綠增菌液內，于42℃培養18～24h。同時另取10mL，加入于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于36±l℃培養18～24h。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經加工的食品不必經過前增菌。各取25mL加入滅菌生理鹽水225mL，按前法做成檢樣勻液，取其半量接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內于42℃培養24h，另半量接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于36±l℃，培養18～24h。4．3分離取增菌液一環，劃線接種于BS平板一個和DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、或SS瓊脂平板)一個。于36±1℃分別培養18～24h(DHL、HE，SS)或40～48h(BS)。觀察各個平板上生長的菌落，沙門氏菌亞屬I、Ⅱ，Ⅳ、V和亞屬Ⅲ在各個平板上的菌落特征見表32—1。4．4三糖鐵高層瓊脂初步鑒別挑選上述選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種到三糖鐵瓊脂斜面試管中，于36±1℃分別培養18～24h，然后根據表32-2初步判斷是否為可疑沙門氏菌。表32-2腸桿菌科各菌屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果斜面底層產氣H2S可能的菌屬－＋＋/－＋沙門氏菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、愛德華氏菌屬＋＋＋/－＋沙門氏菌屬亞屬Ⅲ、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬－＋＋－沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬該表說明在三糖鐵瓊脂內只有斜面產酸并同時H2S陰性的菌株可以排除，其它的反應結果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。因此需要做幾項最低限度的實驗。4．5生化試驗在接種三糖鐵的同時，再接種蛋白胨水(供作靛基質試驗)、尿素（pH7.2）瓊脂、KCN培養基和賴氨酸脫羧酶試驗培養基及對照培養基各一管，于36±l℃培養18-24h，必要時可延長至48小時，按表32-3判斷結果。按反應序號分類，沙門氏菌屬的結果應屬于A1、A2和B1，其它五種結果均可排除。表32-3腸桿菌科各屬生化反應初步鑒別表反應序號H2S靛基質pH7.2尿素KCN賴氨酸脫羧酶判定菌屬A1＋－－－＋沙門氏菌屬A2＋＋－－＋沙門氏菌屬（少見）、愛德華氏菌屬A3＋－＋＋－枸櫞酸桿菌屬、奇異變形桿菌A4＋＋＋＋－普通變形桿菌B1－－－－－－－－＋－沙門氏菌屬、埃希氏菌屬甲型副傷寒沙門氏菌、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬B2－－＋＋－－－－＋－埃希氏菌屬埃希氏菌屬、志賀氏菌屬B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、枸櫞酸桿菌屬B4－＋＋/－＋－摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬注：（1）三糖鐵瓊脂底層均應產酸，不產酸者可排除。斜面產酸與產氣與否均不限。（2）KCN和賴氨酸可選用其中一項，但不能判定結果，仍需補做另一項。（3）＋陽性、－陰性、＋/－多數陽性、少數陰性。（1）反應序號A1典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸三項中有一項異常、按表32—3附1仍可判定為沙門氏菌。如有兩項異常，則按A3，判定為枸櫞酸桿菌。表32-3-A附1pH7.2尿素KCN賴氨酸判定結果－－－甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結果）－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙門氏菌個別變種（要求血清學鑒定結果）（2）反應序號A2可先做血清學鑒定，當A—F多價血清不凝集時，補作甘露醇和山梨醇，按表32—3附2判定結果。表32-3附2甘露醇山梨醇判定結果＋＋沙門氏菌屬靛基質陽性變種（要求血清學鑒定結果）－－緩慢愛德華氏菌（3）反應序號B1三糖鐵斜面產酸的菌株可首先排除，不產酸者可先做血清學鑒定，當A—F多價血清不凝集時，補做鳥氨酸、ONPG、水楊苷、棉子糖和半固體動力試驗，按實驗表32—3附3判定結果。必要時按表32—4，進行沙門氏菌屬亞屬Ⅲ或其它亞屬的鑒定.表32-3附3賴氨酸烏氨酸ONPG水楊苷棉子糖動力判定結果＋＋－－－＋沙門氏菌屬－－－－－－志賀氏菌屬－＋＋－－－宋內氏志賀氏菌屬dd＋ddd埃希氏菌屬注：判定結果時應注意傷寒沙門氏菌鳥氨酸陰性，甲型副傷寒沙門氏菌賴氯酸陰性，雞沙門氏菌無動力。表中d表示有不同反應結果。如果未做KCN試驗時，常需做V-P試驗（22～250C，4天），哈夫尼亞菌屬為陽性。表32-4沙門氏菌屬亞屬的鑒定項目亞屬ⅠⅡⅢⅣⅤ乳糖－－＋/（＋）－－ONPG－－＋－＋衛矛醇＋＋－－＋丙二酸鈉－＋＋－－KCN－－－＋＋水楊苷－－－＋－（＋）遲緩陽性4．6血清學分型鑒定（1）抗原的準備一般采用1.5％瓊脂斜面培養物作玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的(如2．5～3％)培養基上再檢查，如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應時，可挑取菌苔于lmL生理鹽水中作成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發育不良時，將菌株接種在0.7～0.8％半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長后，在其邊緣部分取菌檢查，或將菌株通過裝有0.3～0.4％半固體瓊脂的小玻管1～2次，自遠端取菌培養后再檢查。（2）抗原的鑒定用A—F多價O血清作玻片凝集試驗，同時用生理鹽水作對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。被A—F多價O血清凝集者，依次用O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2、和O11因子血清作凝集試驗，根據試驗結果判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清作凝集試驗，判定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個O抗原成份的最后確定均應根據O單因子血清的檢查結果，沒有O單因子血清的要用兩個O復合因子血清進行核對。不被A—F多價O血清凝集者，先用57種或144種沙門氏菌因子血清中的7種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下：OAl，2，3，4，5，9，10，12，19，2l，26,46OB6，7，8，11，13，14,20，22，23，24OC16，17，18，28，30，35，38OD39，40，41，42，43，44，45OE47，48，50，51，52OF53，54，55，56，57，58，59OG60，61，62，63，65,66，67（3）H抗原的鑒定屬于A—F各O群的常見菌型，依次用下述(表32一5)H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。不常見的菌型，先用144種沙門氏菌因子血清中的6種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查以確定第1相或第2相的H抗原。每一個H抗原成分的最后確定均應根據H單因子血清的檢查結果，沒有H單因子血清的要用兩個H復合因子血清進行核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查。如仍只檢出一個相應的抗原，要用位相變異的方法檢驗其另一個相。單菌相不必作位相變異檢查。表32-5A—F群見菌型H抗原表O群第1相第2相Aa無Βg,f,,s無Βi,b,d2C1k,v,r,c5Z15C2b,d,r2，5D(不產氣的)d無D(不氣的)gmpq無E1hv6，w，xE2h6wE4gst無E4iZ6Fi2HAa，b，c，d，i，Z10，Z29HBe，h；e，n，x；f，g；g，m，s；g，p；m，tHCk，l，v；r，y，Z，Z4，Z23HD1，2；l，5；1，6；1，7；Z6HEZ35，Z36，Z38，Z39，Z41，Z42，Z44HFZ52，Z53，Z54，Z55，Z56，Z57（4）V1抗原的鑒定用V1因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌。5實驗結果綜合以上生化實驗和血清學分型鑒定的結果，按照考夫曼——懷特沙門氏菌屬抗原表解和補充表解判定菌型，并報告實驗結果。6思考題（1）如何提高沙門氏菌的檢出率？（2）沙門氏菌在三糖鐵培養基上的反應結果如何？（3）沙門氏菌屬檢測主要包括哪幾個主要步驟？

實驗4食品中副溶血性弧菌的檢驗1目的要求（1）了解副溶血性弧菌的生長特性。（2）熟悉食品中副溶血性弧菌的檢驗原理。2基本原理副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是近海岸、河口處的棲息生物，常存在于海水、海底沉積物、海產品（魚類、介殼類）及海漬食品中。人們由于食入污染本菌而未充分加熱的海產品或食物可引起食物中毒或胃腸炎。副溶血性弧菌是一種嗜鹽性弧菌，在不含NaCl培養基中不生長，在TCBS平板上，菌落0.5～2.0mm大小，因不發酵蔗糖而呈綠色或藍綠色。3實驗材料3．1菌種副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、大腸埃希氏菌（E.coli）。3．2檢樣魚類、貝類。3．3培養基及試劑氯化鈉結晶紫增菌液、TCBS培養基、3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂、生化試劑等。4實驗方法與步驟4．1副溶血性弧菌的檢測程序（表40-1）圖圖40-1食品中副溶血性弧菌的檢驗程序3737℃，37℃，378～16h樣品25g加225mL3.5％滅菌鹽水，磨碎氯化鈉結晶紫增菌液100mL氯化鈉蔗糖瓊脂平板和選擇性瓊脂平板3.5％氯化鈉三糖鐵斜面嗜鹽性試驗涂片革蘭氏染色鏡檢形態生化試驗報告4．2樣品處理準備好滅菌用具及容器，以無菌操作取有代表性的樣品25g，加入到含有225mL的3.5%滅菌鹽水中，用均質器打碎或用力搖勻10～20min。4．3增菌培養取10mL加入100mL氯化鈉結晶紫增菌液中，搖勻，放37℃培養8～16h。4．4分離培養取增菌液1環劃線接種于TCBS平板，于37℃培養18～24h后，觀察平板上生長的菌落，0.5～2.0mm大小、綠色或藍綠色的為可疑菌落。4．5初步鑒別用接種針挑取可疑菌落，轉種3.5%氯化鈉三糖鐵斜面，37℃培養24h觀察結果。4．6涂片鏡檢將三糖鐵培養基上反應可疑者即底層變黃(葡萄糖產酸不產氣)、上層斜面不變(乳糖、蔗糖不分解)、有動力、不產生硫化氫，進行革蘭氏染色鏡檢形態。4．7嗜鹽性試驗將上述可疑培養物分別接種不同含量的鹽胨水(0％，7％，11％)于37℃24h培養后觀察生長情況，在0％和11％鹽的胨水中不生長，在7％鹽的胨水中生長良好者，繼續進行下列有關試驗。4．8生化試驗分別接種下列各類微量生化培養基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質、V-P，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗，放37℃培養，除V-P、靛基質和甲基紅試驗培養48h后加試劑觀察外，其他均在24h觀察結果。副溶血性弧菌對葡萄糖產酸不產氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，產生靛基質，不產生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，賴氨酸陽性，精氨酸陰性，鳥氨酸多數為陽性少數呈陰性，溶血性多數陽性，有少數不溶血，5結果報告根據鏡檢的菌體形態特征、TCBS平板上菌落特征、生化試驗等判斷樣品中是否含有副溶血性弧菌。6注意事項（1）副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于在低溫生存，在寒冷的情況下容易死亡，所以應防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗結果。（2）樣品中的菌體因受存放條件等的影響，常處于受傷狀態，所以不宜選用抑制性較強的培養基，否則影響細菌生長。7思考題（1）副溶血性弧菌在TCBS平板上有何菌落特征？為什么？（2）鑒定致病性副溶血性弧菌的重要指標是什么？

實驗5食品中金黃色葡萄球菌的檢測1目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢測方法。（2）觀察金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色鏡檢形態以及在血平板和Baird-Parker氏瓊脂平板上生長的菌落特征。（3）觀察金黃色葡萄球菌產生血漿凝固酶現象。圖圖50-1金黃色葡萄球菌檢測程序2基本原理金黃色葡萄球菌可產生多種毒素和酶。在血平板上生長時，因產生金黃色色素使菌落呈金黃色；由于產生溶血素使菌落周圍形成大而透明的溶血圈。在Baird-Parker氏平板上生長時，因將亞碲酸鉀還原成碲酸鉀使菌落呈灰黑色；因產生脂酶使菌落周圍有一渾濁帶，而在其外層因產生蛋白水解酶有一透明帶。在肉湯中生長時，菌體可生成血漿凝固酶并釋放于培養基中（叫做游離凝固酶）。此酶類似凝血酶原物質，不直接作用到血漿纖維蛋白原上，而是被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質，此物質可使血漿中的液態纖維蛋白原變成固態纖維蛋白，血漿因而成凝固狀態。3實驗材料3．1儀器和材料顯微鏡、溫箱、離心機、滅菌吸管（1mL，10mL）、滅菌試管、滅菌平皿、均質器、載玻片、L型涂布棒、酒精燈、接種環。3．2培養基及試劑胰酪胨大豆肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、豆粉瓊脂、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、肉浸液肉湯、兔血漿、革蘭氏染色液等。4實驗方法與步驟4．1金黃色葡萄球菌檢測程序（如圖50-1）

圖50-1金黃色葡萄球菌檢測程序檢樣25g檢樣25g(ml)+225ml滅菌生理鹽水24h36+124h36+124h36+124h36+1直接記數方法增菌培養方法Baird-Parker平板0.3ml、0.3ml、0.4ml7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯血平板血平板，Baird-Parker平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶實驗報告25g樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌4．2增菌培養法（1）檢樣處理稱取25g固體樣品或吸取25mL液體樣品，加入225mL7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯，固體樣品研磨或置均質器中制成混懸液。污染嚴重的樣品用10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯進行增菌（2）增菌及分離培養置36±1℃溫箱培養24h，轉種于血平板和Baird－Parker平板上，36±1℃培養24h，挑取可疑金黃色葡萄球菌菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。（3）形態金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽孢，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5～1μm。（4）培養特征在肉湯中呈混濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，也有時為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。（5）血漿凝固酶試驗吸取新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養物0.5mL，搖勻，放36±1℃培養箱或水浴內，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現凝固，即將試管傾斜或倒置時呈現完全凝塊或者凝固超過原體積的一半，被認為陽性結果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。4．3直接計數法（1）吸取上述1：10混懸液，進行10倍系列稀釋，根據樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入到三塊Baird－Parker平板中，每個平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1h，等水分蒸發后反轉平皿置36±1℃溫箱培養。（2）在三個平板上點數周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個菌落，分別接種血平板，36±1℃24h培養后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養法。（3）將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌的黑色菌落數相加，乘以血漿凝固酶陽性數，除以5，再乘以稀釋倍數，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數。5實驗結果（1）金黃色葡萄球菌涂片染色鏡檢為陽性球菌，致病性葡萄球菌一般較非致病性葡萄球菌小，且各個菌體的大小排列也較整齊。細菌繁殖時呈多個平面的不規則分裂，堆積成葡萄串狀。在中毒食品、膿汁或液體培養基中常呈單個或環球短鏈排列，易誤認為鏈球菌或細球菌。（2）金黃色葡萄球菌在血平板上菌落呈金黃色，周圍有溶血圈，在Baird-Parker平板上菌落呈灰黑色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。（3）致病性葡萄球菌血漿凝固酶為陽性。6注意事項（1）在做樣品中金黃色葡萄球菌計數進行10倍遞次稀釋時，要注意每個稀釋度更換吸管。（2）實驗中操作者須注意生物安全防護，實驗結束后要消毒環境，把實驗材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。7思考題（1）金黃色葡萄球菌引起食物中毒的機理是什么？（2）為什么采用血漿凝固酶試驗來決定葡萄球菌致病和不致病?

附加：實驗6食品中霉菌的計數及生物量的測定1目的要求（1）學習與掌握用平板菌落計數法計數食品中霉菌的原理和方法。（2）掌握測定霉菌生物量的方法。2基本原理稀釋平板菌落計數法是根據微生物在高濃度稀釋條件下固體培養基上所形成的單個菌落是由一個單細胞（孢子）繁殖而成這一培養特征設計的計數方法。先將待測定的微生物樣品按比例作一系列的稀釋后，再吸取一定量某幾個稀釋度的菌液于無菌培養皿中，及時到入培養基，立即搖勻。經培養后，將各平板中計得的菌落數乘以稀釋倍數，即可測知單位體積的原始菌樣中所含的活菌數。稀釋平板菌落計數法既可定性又可定量，所以既可用于微生物的分離純化又可用于微生物的數量測定。霉菌和細菌計數均可采用此方法，區別只在于霉菌和細菌計數所用培養基不同，霉菌培養基里加入了抑制細菌生長的抗生素，另外霉菌培養所使用溫度亦不同于細菌培養。當然，也可以通過測定霉菌菌體的濕重和干重來測定霉菌的生物量，從而了解霉菌生長的狀況。從微生物的培養物中收集菌體稱重為菌體的濕重，經烘干后稱重為菌體的干重。3實驗材料3．1菌種霉菌。3．2培養基馬丁（Martin）孟加拉紅-鏈霉素瓊脂培養基。3．3溶液滅菌生理鹽水。3．4器材溫箱、振蕩