第二章食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第一節(jié)概述一、蛋白質(zhì)和氨基酸的組成與分類

1．蛋白質(zhì)和氨基酸的組成

C,H,O,N,S,P百分百50723160-30-3蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等蛋白質(zhì)的分類

按營養(yǎng)功能分：完全蛋白質(zhì)半完全蛋白質(zhì)不完全蛋白質(zhì)氨基酸的分類按營養(yǎng)功能分：必需氨基酸非必需氨基酸2．蛋白質(zhì)和氨基酸的分類

二、食品中蛋白質(zhì)的含量一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉9.5%，兔肉21%，雞肉20%，牛乳3.5%，帶魚18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黃瓜1.0%，蘋果1.4%

三、測定意義

生物活性功能性質(zhì)營養(yǎng)標簽四、蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)

1．物理性質(zhì)分子量很大黏度大滲透壓低

2．化學性質(zhì)顯色反應沉淀作用變性作用一、蛋白質(zhì)的分離和制備等電點沉淀；鹽析和透析；凝膠柱層析；凝膠電泳第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定

二、蛋白質(zhì)的定性測定1、蛋白質(zhì)的一般顯色反應一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并顯色。2、復合蛋白質(zhì)的顯色反應糖蛋白的顯色脂蛋白的顯色蛋白質(zhì)的測定方法分兩大類：利用蛋白質(zhì)的共性利用蛋白質(zhì)中的特定基團具體測定方法：凱氏定氮法比色法（雙縮脲反應，紫外，染料結(jié)合法儀器分析（紅外分析儀，杜馬斯）三、蛋白質(zhì)含量的測定（一）凱氏定氮法

食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量，然后乘一個蛋白質(zhì)換算系數(shù)。蛋白質(zhì)的含氮量一般為15%~17.6%，有的上下浮動,可以測出總氮.N/16%=N×6.25=蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種[原理]樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。①用H3PO3吸收后再以標準HCl溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過量的標準H2SO4或標準HCl溶液吸收后再以標準NaOH滴定過量的酸。[步驟]整個過程分三步：

消化蒸餾吸收與滴定

1.消化

樣品+濃硫酸加熱

為了加快消化速度，一般添加硫酸鉀、硫酸銅等催化劑，也可加入氧化劑?？偡磻剑?NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O2.蒸餾

消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。

3.吸收與滴定<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標準溶液滴定，采用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠），國標用亞甲基蘭+甲基紅。<2>待完全吸收后，用過量的H2SO4或HCl標準溶液吸收，再用NaOH標準溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。[結(jié)果計算]：式中——蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)；

c——HCl標準溶液的濃度；

V1——滴定樣品吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積；V2——滴定空白吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積；

m——樣品質(zhì)量，g；

M——氮的摩爾質(zhì)量，14.01g／mol；

F——F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為6.25，也可查表。

乳制品K=6.38（N=15.7%）

小麥粉K=5.79（N=17.6%）

動物膠K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆制品K=6.0（16.7%）

[說明]該法可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析。該法所測算出的結(jié)果應為粗蛋白。所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。蒸餾裝置不能漏氣。

⑤

一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。改良式凱氏定氮法【原理】同常量凱氏定氮法【注意事項】一般樣品消化至藍色或淺綠色并澄清后，繼續(xù)消化30分鐘即可。加堿蒸餾操作時，應確保整個蒸餾裝置不漏氣，加入氫氧化鈉的速度要快蒸餾過程中不得停火斷氣，否則將發(fā)生倒吸。微量凱氏定氮法[原理]同常量凱氏定氮法

自動凱氏定氮儀稱取樣品（通常為一克）加入試劑，消解催化劑；在預定溫度下將樣品（6-40個隨消化爐的不同而不同）同時消化（一般條件為420度，30-45分鐘）；經(jīng)冷卻和稀釋，一支消化管和接受瓶放置到儀器上。按下start鍵，起動堿泵加堿，蒸汽泵加蒸汽，硼酸泵向接受瓶中加硼酸。選擇蒸餾時間四—五分鐘，自動完成蒸餾；滴定，計算氮及蛋白含量。

1.雙縮脲分光光度比色法

（1）原理

二、比色法

（2）主要儀器

（3）試劑

（4）操作步驟（5）結(jié)果計算式中：m1——由標準曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；

m——樣品質(zhì)量，g。（6）說明蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度的影響不大。標準曲線做完整之后，無需每次再做標準曲線。當肽鏈中含有脯氨酸時，若有多量糖類共存，則顯色不好，會使測定值偏低。含脂肪高的樣品，易發(fā)生脂渾濁，應預先用有機溶劑除去。該方法測定范圍為1~20mg蛋白質(zhì)，靈敏度較低，適用于需要快速、但精確度要求又不高的蛋白質(zhì)含量測定。常用于谷物蛋白質(zhì)含量測定。

2.乙酰丙酮甲醛比色法

3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氫化吡啶（黃色）[原理]3.其他（1）紫外吸收【原理】

蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸等殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的能力，特征吸收高峰在280nm波長處?！局饕獌x器】【試劑】

【操作步驟】【結(jié)果計算】(2)紅外光譜法

【原理】【應用】(3)其他杜馬斯法（燃燒法）水楊酸比色法福林-酚比色法考馬斯亮藍染料比色法第三節(jié)氨基酸總量的測定

1．單指示劑和雙指示劑甲醛滴定法

2．

茚三酮比色法3．氨基酸自動分析儀法（簡介）

甲醛滴定法

[原理]

單指示劑甲醛滴定法：[試劑]

（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1NNaOH溶液中和（淡蘭色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。（3）0.100N

NaOH標準溶液。[操作步驟]

稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中（如為固體樣加水50ml）→加兩滴指示劑→用0.1NNaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時蘭色應消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。氨基酸態(tài)氮=（N×V×0.014×100）/W×100

[計算]氨基酸態(tài)氮含量（%）=式中：

V1—用百里酚酞作指示劑時消耗氫氧化鈉量，ml。V2—用中性紅作指示劑時，消耗氫氧化鈉量，ml。C—氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L。M—樣品質(zhì)量，g。0.014—1/2氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。

雙指示劑甲醛滴定法

[原理]同單指示劑法[試劑]

中性紅指示劑/百里酚酞指示劑[操作方法]

移取含氨基酸約20-30mg的樣品溶液2份，分別置于250mL錐形瓶中，各加50mL蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別記錄兩次所消耗的堿液mL數(shù)。[計算]式中:--氨基酸態(tài)氮（%）C--氫氧化鈉標準溶液的濃度（mol/L）;V1--用中性紅指示劑滴定時消耗的氫氧化鈉標準溶液體積（ml）;V2--用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積（ml）;M--測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量（g）;0.014為氮的豪摩爾質(zhì)量（g/mmol）[說明及注意事項]（1）此法適用于測定食品中的游離氨基酸。（2）若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定。[原理]

利用各種氨基酸的不同性質(zhì)，使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進行分離。洗脫下來的氨基酸和茚三酮反應生成藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸的含量成正比。[儀器]

氨基酸自動分析儀。[操