羥脯氨酸（HYP）含量檢測試劑盒實驗解決方案原理羥脯氨酸（HYP）是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標。CheKine?羥脯氨酸（HYP）含量檢測試劑盒（微量法）可檢測動物組織，細菌和培養細胞、血清或血漿等生物樣本。在該試劑盒中，樣本經水解產生游離的HYP，進一步被氯胺T氧化，氧化產物與對二甲氨基苯甲醛反應，產生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣本水解液560nm吸光值，可計算HYP含量。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測560nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭、1.5mL離心管、玻璃管·水浴鍋、離心機、烘箱·去離子水、濃鹽酸、無水乙醇、異丙醇、氫氧化鈉試劑準備TissueExtractionBuffer：即用型；6mol/L鹽酸，濃鹽酸：去離子水（V/V）=1:1，室溫保存。（自備）CellExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：本試劑盒組分均有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個人防護。Standard：即用型；0.5mg/mLL-羥基脯氨酸標準品；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。標準品制備：使用0.5mg/mLL-羥基脯氨酸標準品，按照下表所示，進一步稀釋成標準品：序號Standard體積（μL）去離子水體積（μL）濃度（μg/mL）Std.124μL0.5mg/mLStandard37630Std.2200μLofStd.1(30μg/mL)20015Std.3200μLofStd.2(15μg/mL)2007.5Std.4200μLofStd.3(7.5μg/mL)2003.75Std.5200μLofStd.4(3.75μg/mL)2001.875Std.6200μLofStd.5(1.875μg/mL)2000.938Std.7200μLofStd.6(0.938μg/mL)2000.469Std.8200μLofStd.7(0.234μg/mL)2000.234注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩定，必須在4小時內使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。動物組織：稱取約0.2g樣品于玻璃管，加入2mLTissueExtractionBuffer，置于110℃烘箱，水解6-12h，冷卻后用氫氧化鈉溶液調節ph為7.0左右，用去離子水定容至4mL，12,000g，25℃，離心20min，取上清待測。細菌和細胞：收集500萬細菌或細胞到離心管內，加入1mLCellExtractionBuffer，于高壓消毒器中15磅保持30min，自然降壓后用濃鹽酸調節ph為7.0左右，用去離子水定容至2mL，12,000g，25℃，離心20min，取上清待測。血清中游離HYP提取：取0.1mL血清，加入0.5mL無水乙醇使蛋白質沉淀，8,000g，4℃離心5min。將上清倒入另一個EP管，氮吹或沸水浴將乙醇揮發干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇，充分溶解混勻待測。注意：(1)如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。提取過程中可能有黑色物質生成，若長時間不能消化，可能為碳化的物質，不影響實驗。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長到560nm，可見光分光光度計用去離子水調零。操作表（下述操作在1.5mL離心管中操作）：試劑空白管（μL）標準管（μL）測定管（μL）樣本0060Standard0600ReagentⅠ606060混勻，室溫靜置20minReagentII606060去離子水180120120充分混勻，60℃反應20min，取出后室溫靜置15min，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，記錄560nm處吸光值，空白孔記為A空白，標準孔記為A標準，測定孔記為A測定。計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。注意：空白管和標準管只需做1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測定小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA測定大于30μg/mL的ΔA標準，樣本可用相應提取液一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標準曲線的繪制以標準溶液濃度為x軸，ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程，將ΔA測定帶入方程得到x(μg/mL)。HYP含量的計算：按樣本蛋白濃度計算：HYP(μg/mgprot)=x×V樣÷(Cpr×V樣)=x÷Cpr按樣本鮮重計算：HYP(μg/g鮮重)=x×V反總÷(V樣÷V組總×W)=20x÷W按照細菌或細胞數量計算HYP(μg/104)=x×V反總÷(V樣÷V胞總×n)=10x÷n按樣本體積計算：HYP(μg/mL)=x×V反總÷(V樣本÷2)=10xV反總：反應總體積，0.3mL；V樣：反應中樣品體積，0.06mL；V組總：加入組織的提取液體積，4mL；V胞總：加入細菌或細胞的提取液體積，2mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本重量，g；n：細菌或細胞數量，萬；2：血清吹干后復溶的倍數。結果展示以下數據僅供參考，實驗者需根據自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定小鼠腿肌和小鼠心臟中HYP的含量。相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1410CheKine?谷丙轉氨酶（ALT/GPT）活性檢測試劑盒（微量法）KTB1420CheKine?谷草轉氨酶（AST/GOT）活性檢測試劑盒（微量法）KTB14