凝膠層析法分離純化蛋白質凝膠層析法分離純化蛋白質

凝膠層析法分離純化蛋白質【目的】掌握凝膠層析的基本原理學習利用凝膠層析法分離純化蛋白質的實驗技能凝膠層析法分離純化蛋白質

【原理】

凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離的技術。凝膠層析法分離純化蛋白質

凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。凝膠過濾層析凝膠層析法分離純化蛋白質帶網孔的葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內大分子不能進入珠內，經珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖凝膠層析法分離純化蛋白質凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質凝膠珠凝膠層析法分離純化蛋白質總結：相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動，因此流程較短，移動速度快；所以首先流出。相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可完全滲透進入凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，因此流程較長，移動速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們在凝膠顆粒內外部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。凝膠層析法分離純化蛋白質【實驗器材】層析柱恒流泵紫外檢測儀部分收集器試管等普通玻璃器皿凝膠層析法分離純化蛋白質凝膠層析法分離純化蛋白質凝膠層析法分離純化蛋白質凝膠層析法分離純化蛋白質凝膠層析法分離純化蛋白質【實驗試劑】待分離樣品葡聚糖凝膠SephadexG-100洗脫液：0.1mol/LpH6.8磷酸緩沖液凝膠層析法分離純化蛋白質【操作方法】一、凝膠的處理

SephadexG-100干粉經蒸餾水室溫充分溶脹48h，或沸水浴中煮沸2h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆粒空隙中的空氣。

凝膠層析法分離純化蛋白質二、裝柱

關閉出口，向柱內加入洗脫液約1cm高，將濃漿狀的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約1㎝高度后打開出水口，繼續加入凝膠漿，直到凝膠沉積至一定高度即可。裝柱要求連續，均與，無氣泡，無“紋路”。凝膠層析法分離純化蛋白質三、平衡將洗脫液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡，流速為0.5ml/min。凝膠層析法分離純化蛋白質四、加樣與洗脫將柱中多余的液體放掉出，使液面剛好蓋過凝膠，關閉出口，將1ml樣品沿層析柱管壁小心加入，加完后打開底端出口，使液面降至與凝膠面相平時關閉出口，加洗脫液至液層4cm左右，接上恒流泵，開始洗脫（0.5ml/min）。凝膠層析法分離純化蛋白質五、收集與測定用部分收集器收集洗脫液。紫外檢測儀280nm處檢測，將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪制洗脫曲線。凝膠層析法分離純化蛋白質六、凝膠柱的處理凝膠用過后，反復用蒸餾水通過柱（2~3倍床體積）即可。凝膠層析法分離純化蛋白質注意事項各接頭不能漏氣，連續用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內的排氣管應無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內液面不斷下降，則表示整個系統有漏氣之處，應仔細檢查并加以糾