IHC結果分析、疑難解析，分享IHC抗體篩選策略李天月北京義翹神州科技股份有限公司免疫實驗技術全攻略CONTENTIHC技術流程與結果分析1義翹神州IHC常見問題及解決方法2IHC抗體開發案例分享3IHC技術流程與結果分析01義翹神州免疫組織化學（IHC），是應用抗原與抗體特異性結合的原理，通過酶標抗體與底物反應顯色，從而對組織細胞內抗原進行定位、定性及定量的研究。IHC染色原理義翹神州組織取樣固定脫水包埋切片樣本切片制備切片免疫染色CellAntigenPrimaryAntibodyConjugatedSecondaryAntibody底物有色產物IHC技術流程15脫蠟水化抗原修復滅活過氧化物酶24678封閉一抗孵育二抗孵育顯色10111293義翹神州Uniprot數據庫：/IHC染色結果分析SinoBiological官網：/抗原信息抗體信息表達定位表達強度計量方法文獻：/人類蛋白圖譜數據庫：/義翹神州IHC染色結果分析抗原信息抗體信息表達定位表達強度計量方法義翹神州Ki67/MKI67Antibody,MouseMAbCat#:100130-MM19IHCstainingofhumanKI-67in

humanlungcancerwithmousemAb(1:60,formalin-fixedparaffinembeddedsections).IHCstainingofhumanKI-67in

humanbreastcarcinomawithmousemAb(1:60,formalin-fixe

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humanesophagealcarcinomawithmousemAb(1:60,formalin-fixe

dparaffinembeddedsections).義翹神州IHC染色結果分析MembranoushumanbreastcarcinomaAnti-Her2/ERBB2Antibody,MouseMonoclonal(Cat:

10004-MM40)NuclearhumantonsilAnti-Ki67/MKI67Antibody,MouseMonoclonal(Cat:

100130-MM19)CytoplasmhumanliverAnti-P4HBAntibody,RabbitPolyclonal(Cat:

310904-T42)CytoplasmandnucleushumanmalignantmelanomaRecombinantAnti-S100BAntibody,RabbitMonoclonal(Cat:

100508-R034)CytoplasmandmembranehumancolonRecombinantAnti-CES3Antibody,RabbitMonoclonal(Cat:

11129-R033)IHC染色結果分析抗原信息抗體信息表達定位表達強度計量方法義翹神州淡黃色+棕黃色++棕黑色+++IHC染色結果分析抗原信息抗體信息表達定位表達強度計量方法義翹神州

陽性細胞數量染色強度弱陽性，1分（陽性細胞數＜25%）中等陽性，2分（25%＜陽性細胞數＜49%）強陽性，3分（陽性細胞數＞50%）弱陽性（+）1分2（陰性）3（陰性）4（陽性）中等陽性（++）2分3（陰性）4（陽性）5（強陽性）強陽性（+++）3分4（陽性）5（強陽性）6（強陽性）IHC染色結果分析抗原信息抗體信息表達定位表達強度計量方法義翹神州ImageJ1FIJI圖片來自NewDiscoveryIHC常見問題及解決方法02義翹神州高背景非特異染色無染色義翹神州抗體工作濃度過高抗體本身質量問題抗體孵育時間過長，或孵育溫度過高封閉不完全抗原修復方式不合適二抗發生非特異結合洗滌次數不足DAB顯色時間太長，顯色濃度過高抗體工作濃度低，孵育時間短一抗和二抗是否匹配抗體保存不當（反復凍融）檢測組織中不存在目的蛋白組織中目標蛋白豐度不夠稀釋液和洗液的配制是否有誤更換抗原修復方法抗體工作濃度過高抗體本身特異性不佳內源性過氧化物酶活性二抗發生非特異結合一抗的種屬來源與組織樣本的種屬相同（例如，用小鼠一抗測試小鼠組織）切片干片組織內部壞死區域高背景非特異染色無染色邊緣效應染料斑點加液量充足保持切片濕潤，避免干片DAB顯色劑是否過期二抗是否過期，是否有聚集氣泡假象染色不均勻輕柔混勻滴加液體，避免氣泡產生檢查臺面是否傾斜避免直接從熱的修復液取出義翹神州IHC抗體開發案例分享03義翹神州義翹神州雜交瘤技術噬菌體展示文庫技術單B細胞分選技術高效的抗體開發技術平臺：經典技術優化：電融合，建庫技術新技術：單個B細胞技術，更快的速度多種篩選方案組合高效的重組抗體表達高質量的候選抗體庫：數百-數千個候選抗體親和力達到nM-pM水平不同的抗原結合表位適用于不同應用場景Beacon?技術

四大單克隆抗體制備技術抗原設計表位差異性構象正確性抗原易獲得性1免疫方案高滴度免疫效價多表位免疫反應識別功能位點2抗體篩選多樣化篩選平臺快速精準篩選鑒別多功能抗體3表達生產減少外源污染高產能（≥mg級）高通量4質控驗證理化檢測免疫學檢測生物安全檢測……5抗體平臺關鍵技術環節義翹神州佐劑：弗氏佐劑、鋁佐劑、MF59、QS21Titermax、Mn、MPL免疫途徑：皮內、皮下、腹腔、靜脈、淋巴結、脾內免疫周期：常規（7~12周）、快速（3周、5周）免疫劑量：小鼠10~100μg/只次；兔100~500μg/只次……根據最終需求選擇合適的免疫原、佐劑、免疫方式動物免疫效價檢測篩選方式ELISA效價檢測為主，輔助IHC檢測多樣化抗體篩選平臺，關鍵環節進行IHC功能介入篩選IHC指定功能的抗體開發功能需求為導向，盡早開展應用特異性篩選義翹神州案例一：MKI67(Cat:

100130-MM19)抗體篩選鼠上清首篩介入鼠上清亞克隆介入單抗小樣初篩單抗小樣多組織復篩安排大樣生產鼠血清介入單抗大樣多組織復篩單抗大樣初篩靈敏度驗證特異性驗證穩定性驗證其他驗證IVD原料級別義翹神州案例一：MKI67(Cat:

100130-MM19)抗體篩選操作流程：多肽免疫5只小鼠，免疫血清進行ELISA效價檢測和IHC篩選（2個陽性組織、1個陰性組織）挑選ELISA及IHC均合格的1只小鼠融合主克隆階段，ELISA&IHC（雙組織）-->200株結合陽性，首批73株IHC檢測；挑選12株合格克隆進行穩定株篩選2~3次有限稀釋，ELISA&IHC（多組織）--獲得11株ELISA與IHC合格抗體；挑選最優的6株克隆放大生產及抗體純化抗體質控--1株抗體IHC多組織驗證陽性，可作為診斷原料；3株抗體滿足科研試劑要求Control37℃1week37℃2week0.1μg/mL1μg/mL5μg/mL抗體靈敏度驗證抗體特異性驗證加速穩定性驗證抗體經多方面驗證合格，滿足診斷原料需求案例二：Claudin18抗體(Cat:

109916-R179)靶點抗體篩選胃癌1胃癌2胃癌3胃癌4胃癌5胃癌6胃癌7胃癌8胰腺癌1胰腺癌2胃癌1胃癌2胃癌3胃癌4胃癌5胃癌6胃癌7胃癌8胰腺癌1胰腺癌2市售診斷抗體

（3μg/mL）Sinobiological（1μg/mL）義翹神州Claudin18抗體正常組織的表達情況扁桃體膽囊肝睪丸肌肉甲狀腺結腸闌尾淋巴結腦皮膚脾氣管前列腺乳腺腎腎上腺食管胎盤小腸心胸腺胰腺支氣管直腸義翹神州IHC應用抗體共4421株SpeciesQtyHuman3861Mouse399Rat94Rhesus22Cynomolgus15SARS23AntibodyTypeQtyRabbitPAb3880RabbitMAb306MouseMAb230ChimeraMAb5ProductnameCatalogNumberDescriptionIsotypeCD2011007-MM06MouseMAbMouseIgG1CD2110811-MM28MouseMAbMouseIgG1CD3CT026-R301RabbitMAbRabbitIgGCD3410103-MM17MouseMAbMouseIgG1CD6811192-R179RabbitMAbRabbitIgGCD79a100128-R001RabbitMAbRabbitIgGKi-67100130-MM19MouseMAbMouseIgG1LCA100342-R145RabbitMAbRabbitIgGMSH6100973-R035RabbitMAbRabbitIgGMSLN13128-MM01MouseMAbMouseIgG1p5390001-R002RabbitMAbRabbitIgGp63100266-R143RabbitMAbRabbitIgGPD-110377-MM23MouseMAbMouseIgG1S100100508-R034RabbitMAbRabbitIgG100508-MM03MouseMAbMouseIgG1Vimentin100254-R001RabbitMAbRabbitIgG義翹神州義翹神州“一站式”試劑與技術服務蛋白表達和純化服務多種重組蛋白表達系統基因合成密碼子優化載體構建蛋白表達純化抗體表達和純化服務單克隆抗體多克隆抗體磷酸化抗體抗獨特型（Anti-idiotype）抗體嵌合抗體WB/IHC保證型抗體制備ELISA試劑盒開發……生物分析檢測服務SPR/BLI分子互作檢測FcRn結合檢測服務SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike假病毒中和檢測體外活性檢測技術服務生物安全檢測服務CMA&CNAS認證的病毒清除工藝驗證服務雙C認證的細胞庫檢測服務免疫學檢測服務WesternBlot檢測服務流式細胞檢測技術服務ELISA/ELISpot檢測技術服務IHC/IF檢測技術服務IP/Co-IP技術服務堅持自主研發生產打造中國生命科學研究“一站式”試劑與服務支撐平臺人才與設施榮譽資質設施：

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