《保健食品中大豆異黃酮的測定（征求意見稿）編制說明根據《國家標準化管理委員會關于下達2023年第二批推薦性國家標準計劃及相關標準外文版計劃的通知》（國標委發〔2023〕37號），《保健食品中大識別并作用于下丘腦、垂體等組織的雌激素受體（ER），影響動物內源性激素糖苷（Glucoside）、乙酰基葡萄糖苷（Acetylglucoside）、丙二酰基葡萄糖苷（Malonylglucoside）的形式存在，具體有大豆苷、染料木苷、黃豆苷、乙酰大黃豆黃苷；二是游離的苷元型大豆異黃酮（Aglycone），只占總大豆異黃酮的圖1各類大豆異黃酮苷元及苷的結構式A）大豆苷元（A1）大豆苷（A2）乙酰大豆苷（A3）丙二酰大豆苷（B）染料木素（B1）染料木苷（B2）乙酰染料木苷（B3）丙二酰染料木苷（C）黃豆黃素（C1）黃豆黃苷（C2）乙酰黃豆黃苷（C3）丙二酰黃豆黃苷。表1不同類型大豆異黃酮分子量名稱苷元形式苷形式乙酰糖苷形式丙二酰糖苷形式大豆苷元254.24416.38458.41502.42黃豆黃素284.26446.40488.44532.45染料木素270.24432.38474.41518.42保健食品產品注冊申報與審評有關規定的通知根據國家市場監督管理總局官網有關大豆異黃酮保健食品注冊信息，截至在檢測方法方面，大部分企業采用GB/T23788規定的測量方法，大豆異黃分企業采用《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）中“金雀異黃素的測也有報道采用酶聯免疫法及毛細管電泳法測定。GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法-高效液相色譜法》為目前用于保健食品中測定大豆異黃大豆異黃酮相關檢測標準共5種，包括2種國家標準、2種農業表2國內不同大豆異黃酮的檢測方法NY/T3112-2017NY/T1252-2006豉量波清洗器中60℃提萃取柱中，用萃取柱中，用粒度5μm不銹鋼色RPC18柱流動相A：乙腈；流動相A：0.1%乙流動相A：含有//甲醇水溶液，以80%甲醇為主；檢測波長多為260nm，與實際紫外吸收光譜圖如果縮短大豆異黃酮的檢測時間，通常使用超高效液相色譜法，檢測時間為表3不同文獻中關于大豆異黃酮的測定方法文獻超高效液相色譜法同時測定種大豆異飼料中大豆異黃酮檢測方法豆芽發芽過程中黃酮類成分的檢測及超高效液相色譜法檢測保健品中的大豆異黃酮高效液相色譜法測定保健食品中大豆異黃酮含量的方法改進豆漿中水溶性大豆異黃酮檢超高效液高效液相高效液相超高效液相高效液相色高效液相色譜法檢測料木素和豆黃素和大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料大豆苷、大豆黃素、染料木苷、大豆素、大豆黃苷、染料提取超聲提取甲醇超聲70%甲醇超超聲提取80%甲醇超水色譜柱HC18色譜柱AgilentZOR流動相乙腈（A）流動相A為磷酸水乙腈；流動色譜流動相A的0~磷酸水溶液至14~磷酸水溶液25~磷酸水溶液檢測GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法》于以下問題1）缺少大豆異黃酮樣品制備步驟2）大豆異黃酮現有色譜條件需優化3）現有色譜條件易與其他類黃酮類物質（芍藥苷）保留時間重合；“14項保健食品分析方法標準啟動會”修訂工作啟動會，會上討論了《保健食品中大豆異黃酮的測定》的修訂方案。組織各參與單位開展新修訂保健食品中大豆異黃酮測定方法的實驗室間方法驗本標準依據GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》和GB/T20001.4-2015《標準編寫規則》的要求進行編寫，按照GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法》描保健食品中大豆異黃酮的測定基本采用高效液相色譜法，以GB/T23788-2009為基礎修訂后的標準，適用于片劑、膠囊、口服液和酒劑等劑用性不足。通過多方面分析和驗證，本次標表4標準主要修訂要點苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素這6原標準對于標準品名稱有通效液相色譜儀分析（C18柱分離），依據分析（C18柱分離標準溶液原標準稱取4mg標準標準品稱取25mg標準品，先用二甲基亞溶解后即可使用甲醇定容至刻度。參考真實樣品測試數據，在大豆異黃酮保健食品試樣前處理色譜柱粒度5μm不銹鋼色譜烷基鍵合的表面多孔型反相色譜柱，4.6流動相流動相A：乙腈；流動公式根據市售大豆異黃酮樣品進檢出限定5mg/kg，液體檢出限素）和9種糖苷（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、乙酰大豆苷、乙酰黃豆黃苷、乙酰染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰黃豆黃苷、丙二酰染料木苷），修改后，），babadcdc圖2不同溶劑稀釋大豆異黃酮標準品色譜圖（a50%二甲基亞砜，b50%甲醇稀釋，c80%范圍，在試樣處理步驟增加“必要時，可適當增加或減少稀釋倍數f，使試樣中取片劑、顆粒劑（不低于20粒或10g）試樣，經高速粉碎機或研缽磨成粉狀，原標準規定稱樣量為0.05~0.5g，在本次修訂過程中修改了樣品的取樣量：醇提取，為驗證提取溶劑有效性，考察了40%乙腈、80%乙腈、80%甲醇、80%乙醇、70%甲醇、90%甲醇作為提取溶液的提取效率。從測定結果看（表5），于40%乙腈，片劑使用40%乙腈提取效果最好，綜合考慮，沿用原標準的提取表5不同提取溶劑對大豆異黃酮測定結果/原標準中使用50mL棕色容量瓶超聲震蕩結果顯示，大豆苷和大豆苷元在250nm處有最大吸收，黃豆黃苷和黃豆黃素在258nm處有最大吸收，染料木苷和染料木素在260nm處有最大吸收，綜合操作圖3大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的紫外光譜圖中有些成分可能會對大豆異黃酮定量有影響。在前期的實ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱）對多種黃酮類物質分離效果有限，芍藥苷在adadbebecfcfe賽默飛測定大豆異黃酮6種標準品，f賽默飛測定大豆異黃酮6種標準品和芍制流程。參考文獻，選擇0.01%磷酸水溶液和0.1%乙酸水溶液。如圖5所示，adadbebecfcf水溶液，b安捷倫0.01%磷酸水溶液，c安捷倫0.1%乙酸水溶液，d月旭pH=3附。比較離心、棄初濾液1mL、棄少量1mL）初濾液3種方式對不同基質1mL）初濾液會降低各組份濃度，造成結果偏差。表6不同過膜方式對大豆異黃酮濃度的影響內大豆異黃酮注冊產品主要以g/100g和g/100mL為單位，因此將標回收率在92.20%~98.91%，相對標準偏差RSD在0.79高水平方法加標試驗中，四種基質中大豆苷的加標回收率在收率在94.75%~98.56%，相對標準偏差RSD在0.回收率在95.54%~98.20%，相對標準偏差RSD在0.5場監督的有效性。綜上所述，修訂后的標準實驗室內方法學驗證滿足AOAC2008.03和美國藥典（USP）收載的大豆異黃酮測定方法均采用了標準圖譜比對法，實現了通過6種異黃酮（大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃素黃素、的結果偏差（圖6AOAC2008.03規定了兩種異黃酮總量計算的兩種方式：一7），先將乙酰類及丙二酰類大豆異黃酮苷進行皂化水解，當全部轉表7AOAC關于大豆異黃酮測定的方法標準號AOACOfficialMethod2001.10IsoflavonesinSoyandSelectedFoodsContainingSoyExtraction,Saponification,andLiquidChromatographyFirstAction2001AOACOfficialMethod2008.03TotalSoyIsoflavonesinDietarySupplements,SupplementIngredients,andSoyFoodsHigh-PerformanceLiquidChromatographywithUltravioletDetectionFirstAction2008基質大豆提取物、大豆飲料、大豆粉等商業膳食補充劑中總大豆異黃酮、用于制造膳食補充劑的大豆異黃酮濃縮物以及含有至少0.5mg/g總異黃酮的大豆食品標準品大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃素黃素、染料木苷、染料木素大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素方法高效液相色譜法高效液相色譜法提取方式將樣品使用80%甲醇在65°C水浴中振搖提取2h，冷卻至室溫，加入3mL2mol/L氫氧化鈉。置搖床旋搖10min后加入1mL冰醋酸，定容后稀釋上機將樣品使用40%乙腈振蕩60min，振蕩結束后，稀釋含有80%乙腈溶液，稀釋上機流動相流動相A：水：甲醇：乙酸=88+10+2，流動相B：甲醇：乙酸=98+2流動相A：0.05%磷酸，流動相B：乙腈測定時間45min73min標準品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷大豆苷元、黃豆黃素、染料木素大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷大豆苷元、黃豆黃素、染料木素注：圖譜比對法，需要用標準大豆粉定性乙酰和丙二酰異黃酮苷計量方式異黃酮總量：以異黃酮苷元及異黃酮苷相當于苷元的總和計（1）異黃酮總量：以12種異黃酮形式的總和計（2）異黃酮總量：以異黃酮苷元及異黃酮苷相當于苷元的總和計圖6AOAC2008.03色譜圖（a.大豆異黃酮標準品圖譜，b.某軟膠囊大豆異黃酮圖譜，c.加熱后的大豆粉，d.未加熱的大豆粉）圖7AOAC2001.10色譜圖（a.大豆異黃酮標準品圖譜，b.某軟膠囊大豆異黃酮圖譜）附件一保健食品中大豆異黃酮的測定方法學驗證表8空白基質雜質峰和色譜峰保留時間碼苷苷元素素///準圖8空白基質色譜圖圖9空白基質和目標峰色譜圖測定：選取空白樣品基質20個平行樣，分別添加估算檢出限濃度的目標分表9方法檢出限驗證結果基質目標分析物檢出數量目標分析物檢出率硬膠囊20軟膠囊20片劑20液體口服液20接受標準目標分析物檢出率≥95%結論空白輔料不干擾主成分測定表10保健食品分析方法定量限驗證估算結果測定：采用估算定量限濃度水平的有證標準物質/標準樣品進行獨立檢測，表11方法定量限驗證結果123456囊苷NDNDNDNDNDND囊苷NDNDNDND10NDND苷NDNDNDND0ND0ND苷NDNDNDNDNDNDND：未檢出表12方法的標準曲線12345收率在94.75%~98.56%，相對標準偏差RSD在0.回收率在95.54%~98.20%，相對標準偏差RSD在0.5GB5009.295-2023《食品安全國家標準化學分析方法表13低水平方法正確度和重復性驗證結果123456囊苷NDgNDgNDgNDgNDgNDg囊苷NDgNDgNDgNDg1NDgNDg苷NDgNDgNDgNDgNDgNDg苷NDNDNDNDNDNDND：未檢出表14中水平方法正確度和重復性驗證結果)123456大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料ND大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料ND大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料ND大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料NDND：未檢出表15高水平方法正確度和重復性驗證結果123456苷NDNDNDNDNDND苷NDNDNDNDNDND苷NDNDNDNDNDND苷NDNDNDNDNDNDND：未檢出表16標準儲備液穩定性結果17結果，試驗結果見表17。標準方法修訂后不會對市場上的該類保健食品監管產表17不同大豆異黃酮實際測量值黃豆染料木大豆苷黃豆黃染料木大豆異黃編大豆苷新標準/名稱劑型方法黃苷苷元素素酮總含量號g/100g原標準g/100gg/100gg/100gg/100gg/100gg/100g1樣品1軟膠囊新標準2.730.880.230.075.22101.35%原標準2.680.860.230.07標簽值2.00/0.88/0.073.002樣品2硬膠囊新標準8.914.450.220.0715.94100.67%原標準8.814.412.200.220.0715.83標簽值//////11.503樣品3軟膠囊新標準2.870.714.870.048.86101.21%原標準2.780.684.870.048.76標簽值/2.550.04/0.014.474樣品4軟膠囊新標準0.242.600.280.070.265.37原標準0.232.640.280.070.265.36標簽值3.4mg3.5mg0.08mg0.02mg7mg5樣品5片劑新標準0.720