蛋白質工程的原理和應用二代基因工程ThebasictoolsofrecombinantDNAtechnology學習目標通過完成“改造Bt蛋白，增強殺蟲效果”的任務，由蛋白質的功能推測相應結構，再進一步推測氨基酸序列和基因序列，發展結構與功能觀、信息觀；通過由改造Bt蛋白和設計人工蛋白質的流程，歸納總結改造一般蛋白質的思路，發展歸納與推理的學科思維。1、你還記得抗蟲棉是怎么培育出的嗎？2、如果在生產過程中，棉鈴蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性、Bt蛋白毒力下降，如何解決？情景再現蛋白質結構研究的進展晶體學、分子生物學和計算機技術等活動一：改造Bt蛋白基于對蛋白質結構與功能的較深入了解，部分科學家提出了通過改造Bt蛋白結構來提高其殺蟲功能。請你嘗試推測科學家“改造Bt蛋白，增強殺蟲效果”的可能思路。資料1：不同于人類腸道的酸性環境，昆蟲的腸道為堿性環境，Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，在堿性環境中多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，使害蟲滲透壓失衡而死亡。活動一：改造Bt蛋白資料2：Bt抗蟲蛋白包含三部分結構，其中結構Ⅰ由多個α螺旋組成，5號α螺旋(α5)中央疏水、且其螺旋長度足以跨過3nm厚的細胞膜的疏水區，而結構Ⅱ、Ⅲ并未發現足夠長度的疏水區域，研究人員推測結構Ⅰ可能參與昆蟲腸上皮細胞膜中孔道的形成。結構Ⅰ研究人員推測結構Ⅰ可能與昆蟲腸上皮細胞孔道的形成有關，這種推測合理嗎?活動一：改造Bt蛋白資料3：Bt抗蟲蛋白結構Ⅰα5螺旋通過6聚體的形式，即以α5螺旋的親脂側向外、親水側向內形成親水離子通道，由于第168位的組氨酸殘基存在于疏水表面的中間，對于6聚體的穩定存在非常重要，研究人員推測:氨基酸的改變可能會引起蛋白質空間結構的細微差異和功能的改變，他們嘗試用疏水性更強的精氨酸代替組氨酸來對Bt抗蟲蛋白進行改造毒性提高3倍。思考：從難易程度、可持續性角度考慮，可以直接對蛋白質進行改造嗎？如果要將Bt抗蟲蛋白的改造成果應用到生產實踐中，還要做哪些工作？活動二：改造Bt蛋白基因DNA核苷酸序列（模板鏈）——AATGTAGAA————TTACATCTT——168位RNA——UUACAUCUU——氨基酸鏈——亮氨酸-組氨酸-絲氨酸————亮氨酸-精氨酸-絲氨酸——注：精氨酸密碼子：CGUCGCCGACGG（四種密碼子均可在棉花中使用）。改造后氨基酸鏈改造后RNA改造后DNA5'3'活動二：改造Bt蛋白基因目的：實現基因的體外定向突變大面積的定向突變：基因全合成法單一位點的定向突變：PCR等—GTA—→—GCA—引物定點引入法5'3'5'3'（模板鏈）GTACATCGT完成導學案，思考經過幾輪復制，我們可以得到想要的目的基因？活動二：改造Bt蛋白基因5'3'5'3'（模板鏈）GTACGT思考：經過PCR得到的都是我們需要的目的基因嗎？歸納總結他科學家應用相同的思路對Bt蛋白進行的改造，例如:將Bt蛋白中第372位的天冬酰胺殘基用丙氨酸或甘氨酸替換后，對舞毒蛾幼蟲毒性提高了8倍;將Bt蛋白中第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸用甘氨酸和絲氨酸取代，對舞毒蛾毒力提高7倍。歸納總結回顧本節課的過程，我們是如何一步一步的完成對Bt蛋白的改造的？1、預期Bt蛋白有更強的殺蟲功能1、預期蛋白質的功能2、推測結構Ⅰ中的5號螺旋可能參與上皮細胞孔道的形成，與殺蟲功能有關3、預測結構Ⅰ的新氨基酸序列，將168位的組氨酸替換為精氨酸4、根據密碼子設計相應的Bt抗蟲基因核苷酸序列2、推測蛋白質的相應結構3、推測氨基酸的序列4、設計改造后的基因序列歸納總結蛋白質工程的一般操作流程概念：以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系為基礎，對編碼該蛋白的基因進行有目的的設計改造，以改造現有蛋白質或制造新的蛋白質。聯系實際1、對于不能預先確定誘變位點的蛋白質，可采用非定點誘變技術來進行蛋白質改造。針對性不強，但由于突變位點多，有時會產生意想不到的改造效果。2、蛋白質工程不僅能更充分地利用自然界中存在的蛋白質，而且能在分子水平上對蛋白質進行再設計和改造，進而創造出自然界中不存在的蛋白質。3、蛋白質工程仍需要轉基因