ICS07.080

CCSC10

團體標準

T/CIXXXX—XXXX

用于疾病治療的間充質干細胞質量要求

Qualityrequirementsofmesenchymalstemcellsfortherapy

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

中國國際科技促進會發布

T/CIXXXX—XXXX

用于疾病治療的間充質干細胞質量要求

1范圍

本文件規定了用于疾病治療的人體間充質干細胞（MSCs）的關鍵生物學性質、生物效力、安全性、

標簽、包裝、儲存、運輸、檢測報告的要求，界定了是否是優質MSCs的指標，給出了鑒定MSCs有無復制

性衰老的基本參數，提供了用于特定適應癥MSCs的基本質量要求。

本文件適用于疾病治療的人體間充質干細胞及其制品的研發、生產和臨床應用。

2規范性引用文件

本文件沒有規范性引用文件。

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

干細胞stemcell

具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下可分化成多種功能細胞。

間充質干細胞mesenchymalstemcell,MSC

一類存在于多種組織（如骨髓、臍帶血、臍帶組織、胎盤組織和脂肪組織等），具有一定的自我

復制更新和多向分化潛能的成體干細胞。

分化能力differentiationpotential

在體外特定誘導分化培養條件下，細胞向多種預設目標細胞分化的功能。

細胞表面標志物cellsurfacemarker

細胞膜表面上特異性表達的標志性蛋白和分子。

細胞存活率cellsurvivalrate

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比。

MSC的異質性MSCheterogeneity

體外培養的MSCs在細胞形態、表面標志、分化潛能和分泌物等方面表現出不均一的特征。

復制性衰老replicativesenescence

細胞遺傳物質復制和細胞分裂能力有限,在經過有限次數的復制和分裂后，細胞發生形態和結構的

顯著變化并逐漸失去復制和分裂的能力。

免疫抑制immunosuppression

對于免疫應答的抑制作用,通過抑制與免疫反應有關細胞（T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等）

的增殖、分化和成熟等功能，來降低免疫反應。

細胞群體倍增時間populationdoublingtime,PDT

細胞在培養條件下生長時其數目倍增所需的時間。

抗炎作用anti-inflammatoryeffect

1

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通過特異地抑制或拮抗一種或幾種炎癥介質和相關的活性物質，達到減輕炎癥反應和對組織細胞

的損傷的效果。

組織修復tissuerepair

局部組織、細胞因致病因素導致損傷和死亡后，由鄰近健康細胞再生來修補頂替，以恢復組織完整

性的過程稱為組織修復。

纖維化fibrosis

可發生于多種器官，主要病理改變為器官組織內纖維結締組織增多，實質細胞減少，持續進展可致

器官結構破壞和功能減退。

核質比karyoplasmicratio

一個細胞的核與細胞質在量(容積)上的比例。

MSC歸巢MSChoming

在多種因素的作用下，MSC能定向趨向性遷移，越過血管內皮細胞至靶向組織并定植存活的過程。

細胞凋亡apoptosis

為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。

活性氧reactiveoxygenspecies,ROS

體內一類氧的單電子還原產物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的

氧生成的。

2-

注：包括氧的一電子還原產物超氧陰離子(O)、二電子還原產物過氧化氫(H2O2)、三電子還原產物羥基自由基(·OH)

以及一氧化氮等。

外泌體exosome

包含了多種RNA分子和蛋白質的雙層質膜小囊泡，直徑在30nm～150nm，具有其來源細胞的相似調

節功能。

核質橋nucleoplasmicbridges，NPB

細胞多次分裂后，由于遺傳物質的重排而形成的環形染色體或雙中性染色體。

核型karyotype

一個體細胞中的全部染色體在有絲分裂中期，按其大小、形態特征(著絲粒的位置）順序排列所構

成的圖型。

集落colony

將細胞以極低密度接種培養一段時間后，由單個細胞生長分裂形成由大于50個細胞聚集的細胞克

隆。

成瘤性tumorigenicity

細胞接種到免疫缺陷動物體內后在注射部位和（或）轉移部位由接種細胞所形成腫瘤的能力。

高表達highexpression

與用10%FBS培養的第一代MSCs比較，細胞因子的表達量明顯升高。

低表達lowexpression

與用10%FBS培養的第一代MSCs比較，細胞因子的表達量明顯降低。

2

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無血清和無異種蛋白培養基serum-freeandxeno-freemedia

一種無血清、不含異種蛋白、化學性質明確的培養基,富含多種促間充質干細胞增殖和分化的細胞

因子、化學因子和調節分子,具有更高的生物安全性和有效性。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

AM-MSC：羊膜間充質干細胞（AmnioticMesenchymalStem/StromalCell）

Ang-1/II：血管生成素1/2（Angiopoietin-1/II）

APLL-37：抗菌肽LL-37（AntibacterialpeptideLL-37）

ASK1：凋亡信號調節激酶1（Apoptosissignal-regulatingkinase1）

BDNF：腦源神經營養因子（Brain-derivedneurotrophicfactor）

CD：細胞膜表面分化抗原簇（ClusterofDifferentiation）

C/EBPb：普通轉錄因子c/ebpb（CCAAT/enhancerbindingproteinb）

CNTF：睫狀神經營養因（Ciliaryneurotrophicfactor）

COX-2：環氧化酶-2（Cyclooxygenase-2）

CXCR4：CXC化學受體4（CXCchemokinereceptor4）

CXCR7：CXC化學受體7（CXCchemokinereceptor7）

DT-MSCs：用于疾病治療的MSCs（Diseasetreatmentmesenchymalstemcells）

EBV：皰疹病毒（Epstein-Barrvirus）

EGF：表皮細胞生長因子（Epidermalgrowthfactor）

GDNF：膠質來源的神經營養因子（Glial-derivedneurotrophicfactor）

GSH：谷胱甘肽（antioxidantglutathione）

Gpx：谷胱甘肽過氧化酶（glutathioneperoxidase）

HGF：肝細胞生長因子（Hepatocytegrowthfactor）

Hif-1：低氧誘導因子-1（Hypoxia-induciblefactor-1）

HLA-G5：人白細胞抗原G5（Humanleukocyteantigen-G5）

HMOX1：血紅素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1）

HO-1：血紅素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1）

HSP70：熱休克蛋白70（heat-shockprotein70）

HTLV：人類嗜T細胞病毒（humanT-lymphotropicvirus）

IDO：吲哚胺-2,3-雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase）

IFITM：干擾素誘導跨膜蛋白（Interferon-InducedTransmembraneProtein）

IGF-1：胰島素樣生長因子1（Insulinlikegrowthfactor1）

IL-1ra：白介素1受體拮抗劑（IL-1receptorantagonist）

IL-10：白介素10（Interleukin-10）

KGF：角質細胞生長因子（Keratinocytegrowthfactor）

KRIT1：Krev/Rap1相互作用陷阱-1（Krev/Rap1interactionTrapped-1）

MEF2：肌增強子2（myogenicenhancerfactor2）

MFGE-8：乳脂肪球表皮生長因子-8（Milk-fatglobuleepidermalgrowthfactor-8）

MMP-2：基質金屬蛋白酶2（Matrixmetalloproteinase-2）

MMP-9：基質金屬蛋白酶9（Matrixmetalloproteinase-9）

MSC：間充質干/基質細胞（MesenchymalStem/StromalCell）

NFE2L2：核因子紅系2相關因子2（Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2）

NO：氧化氮（Nitricoxide）

NPB：核質橋（Nucleoplasmicbridges）

PD-L1：程序性細胞死亡配體1（Ligandsforprogrammedcelldeath1）

PGE2：前列腺素E2（ProstaglandinE2）

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PTGS2：前列腺素內過氧化物合酶2（Prostaglandin-endoperoxidesynthase2）

ROS：活性氧簇（Reactiveoxygenspecies）

SA-β-gal：衰老相關的β-半乳糖苷酶（Senescence-associated-β-galactosidase）

SAHF：衰老相關的異染色質位點（Senescenceassociatedheterochromaticfoci）

SASP：衰老相關的分泌型（Senescenceassociatedsecretoryphenotype）

SOD：超氧化物歧化酶（Superoxidedismultase）

STC1/II：斯鈣素1/2（Stanniocalcin-1/II）

TGF-β：轉化生長因子-β（Transforminggrowthfactor-β）

TIMP-1：基質金屬蛋白酶抑制劑-1（Tissueinhibitorofmetalloproteinase-1）

TP：梅毒螺旋體（Treponemiapallidum）

TRX：硫氧還蛋白（Thioredoxin）

TSG6：TNF-α誘導蛋白6（TNF-α-inducedprotein6）

5DT-MSCs的關鍵質量屬性

MSCs質量控制和臨床治療的關系

MSCs的基本生物學特性應包括細胞的形態、結構、功能和生命活動，它涉及顯微、亞顯微和分子水

平的不同層次。用無血清和無異種蛋白培養基培養的DT-MSCs和其它用途的P1代MSCs相比，在下述生物

學特性方面須優于后者。高質量的DT-MSCs是確保臨床治療安全和有效的關鍵所在。

細胞形態、大小和生長方式

貼壁狀態下為短棒形或小梭形，懸浮狀態下細胞呈圓形；根據懸浮狀態下細胞的直徑大小，可分為

10μm≤優良群≤16μM、16μm≤合格群≤21μm）和不合格群（大于21μm）。體外培養的MSCs形態均

一、呈螺旋樣生長。

細胞核質比

應有一個圓形而光滑的細胞核，核質比應大于1。

細胞存活率

應符合以下要求：

a)細胞制品制備完成時，細胞存活率≥99%；

b)細胞制品從制備完成到使用前，2℃～6℃環境下保存12小時內，細胞存活率≥95%；

c)細胞制品從制備完成到使用前，18℃～25℃環境下保存4小時內，細胞存活率≥95%。

d)細胞冷凍復蘇后的存活率≥90%；

細胞群體倍增時間

18h≤優良群≤26h,26h≤合格群≤32h，32h≤不合格群。

細胞標志物

5.6.1通用陽性表面標志物群，包括但不限于CD29、CD73、CD90、CD105、CD44、CD166，陽性率≥99%。

5.6.2陰性表面標志物群，包括但不限于CD11b、CD14、CD19、CD79a、CD34、CD45、CD31，CD80和CD86，

陽性率≤1%。

5.6.3特殊基因表型和表面標志物SSEA-4、SCA-1、PDGFRα、STRO-1、CD271和CD146表達陽性。

免疫表型

在正常穩態條件下，MSC可表達MHC-I型抗原如HLA-ABC,而HLA-Dr<2%。

染色體核型

染色體核型應為46，XX或46，XY；無缺失、重復、倒位、易位等結構異常。

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無細胞衰老特征

與P1代細胞相比,下述指標變化不明顯，P>0.05。

a)細胞體積增大、形態各異、群體倍增時間增加；

b)p53、p21和p16基因表達；

c)小于5%細胞的β-半乳糖苷酶活性或核內PrelaminA堆積；

d)小于5%細胞的γH2AX和53BP1異染色質位點；

e)表達TNF-α、IL-1β、MMP3、IL8、IL12、MCP1/2；

f)表達miR-155-5p、miR-29c-3p或miR-495；

g)脂褐質（lipofuscin）增多；

h)下調與自噬功能相關的LC3B、ATG12-5、Beclin-1；

i)DNMT1andDNMT3B下調；

j)低表達CD134和CD264。

細胞周期

細胞周期中處于G0/G1期和S期的DT-MSCs應≤90%，而處于G2/M期的應≥10%。

集落形成

DT-MSCs的集落形成率≥15%。

遺傳穩定性

5.12.1培養至10代，未出現染色體異常，未出現NPB增多。

5.12.2培養至20代，在體外長期擴增中不/低表達腫瘤細胞相關的Meflin、TGF--β和BMP表型。

線粒體和活性氧

5.13.1線粒體應符合以下特征要求：正常的膜電位（MMP檢測線粒體中m-MPI為紅色熒光）和ROS低

含量。

5.13.2miR-21、miR-155-5p低表達；KRIT1、NFE2L2、SOD1/2、HMOX1和KRIT1高表達。

細胞株鑒定

人源短串聯重復序列（STR）圖譜分析應為單一細胞來源。

6DT-MSCs的標志性生物效力

MSCs的生物效力和疾病治療的關系

間充質干細胞治療的工作原理主要包括二個方面；其一，干細胞可以分化成不同功能的細胞，它們

可以再生填補組織器官中丟失和死亡的原有功能細胞；其二，MSCs可以合成和分泌多種不同形式的囊泡

和分子，刺激原有干細胞的分化，修復病變和受損的細胞。因此，為了獲得臨床療效，在治療不同適應

癥時，要求所用的DT-MSCs與P1代的MSCs相比，應表達特征性基因和具有相應的生物學效力。

分化潛能

用于不同適應癥的MSCs應具有多譜系分化潛能，可分化為相應的前體細胞，如骨、軟骨、肝臟、神

經、肌肉、脂肪、血管和上皮細胞等前體細胞。

a)如分化為成骨細胞，應能表達Runx2、miR-34a、miR-21、miR-342-3p、miR-196a-5p和miR-

210，或其它特征性基因；

b)如分化為軟骨細胞，應能表達Sox9、PTHrP、miR-381-3p或其它特征性基因；

c)如分化為肝臟細胞，應能表達BMP2、AFP、CYP2B6、HNF4、claudin和miR-122-5p、miR-23b、

miR-30a、miR-148a、miR-542-5p或其它特征性基因；

d)如分化為神經細胞，應能表達Nestin,TUJ1,ENO2,PAX6、BDNF、NGF、miR-9-5p、miR-324-

5p、miR-206,miR-34a,miR-374,miR-424或其它特征性基因；

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e)如分化為肌母細胞，應能表達MEF2、a-sarcomericactin、CD105+、miR-503和miR-21,miR-

23a,或miR-125b和miR-222-5p或其它特征性基因；

f)如分化為脂肪細胞，應能表達PPARγ和CCAAT/增強子結合蛋白-a或其它特征性基因；

g)如分化為上皮細胞，應能表達CK-19、CK-5、CCSP-26和SP‐C、miR-145或其它特征性基因；

h)如分化為內皮細胞，應能表達CD31、VWF、和eNOS、miR-342-3p或其它特征性基因。

自我更新能力

6.3.1應表達NANOG、SOX-2、OCT4、SSEA-4、KLF4、TERT或其它多能干性基因。

6.3.2應表達miR-486-5p、miR-10a-5p或其它標志性miRNAs。

應具有合成和分泌外泌體的能力

分泌的外泌體特征應符合表1要求。

表1外泌體特征

指標要求

濃度4～8×1011個/ml

大小30nm～150nm

密度1.13g/ml～1.19g/ml

標志蛋白CD63+、CD81+、CD73+（FACS陽性率≥10-15%)、Alix和TSG101

CD9+、CD29+、CD44+、CD49e+、CD63+、CD81+、CD105+、MCSP+、CD14-、CD19-、

表型

CD34-、CD45-、CD142-、MHC-I/II-

表達標志性miRNAs和蛋白質let7、miR-10b-5p,miR-21、miR-23a-3p、miR-34、miR-221/222、miR-23a-3p、

miR-486-5p和/或其它標志性蛋白質

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性。

趨化/歸巢能力

6.5.1應能高表達CCR1/3-7,CXCR2/4-7、CXCL2,CXCL5-10；MMP1/2(gelatinaseA)、MMP8/9、TIMP-

2、PDGF-AB,IGF-1,RANTES,MDC,SDF-1。

6.5.2應具有高表達miR-34a或其它標志性miRNAs的能力。

抗凋亡能力

6.6.1應具有過氧化氫酶、HO-1、HIF-1α、Bcl2、BAX、IGF-1、FGF-b、HGF、GDNF、VEGF、GM-CSF、

STC1/2、TIMP3和線粒體運載蛋白Miro1的表達能力。

6.6.2應具有高表達miR-let-7a、miR-let-7e、miR-301a或其它標志性miRNAs的能力。

抵抗微生物的能力

應具有高表達Lipocalin2、IFI6,PMAIP1,ISG15,SAT1、defensins,cystatinC,elafin和

cathelicidin的能力。

抗炎能力

6.8.1應具有合成和分泌抗炎蛋白TSG6、IL-1ra、PGE2、STC1、TNFR1、HGF、和IL-10的能力。

6.8.2應有分泌miR-223、miR-126、miR-21a-5p、miR-146a、circ-Rps5或其它標志性miRNAs的能力。

6.8.3應能誘導CD68+F4/80+M0或CD14+CD80+M1型巨噬細胞轉變成CD206+CD86+M2型，增加M2/M1

的比值，高表達Ym-1+或SPHK1andLIGHT蛋白。

抗纖維化能力

6.9.1應具有HGF、FGF-b、MPP-1、3、9/14、STC1、MFGE-8、IL-10、TRX和PGE2的高表達能力。

6.9.2應具有下調TGF-β1、Smad2/3和TIMP1/2和Snail等蛋白的表達能力。

6.9.3應具有miR-21-5p,miR-23,miR-221/222、miR-34a-5p、miR-27b、miR-148a-5pmiR-153-3p

miR-335-5p或其它標志性分子的高表達能力。

抗氧化能力

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應具有Nrf1/2、C/EBPb、NFE2L2、SOD1/2、HMOX1、HO-1、catalase(CAT)、sirtuin(SIRT)、GSH、

Gpx、HSP70、STC1、miR-29a-3pandmiR-30c-5p或其它標志性分子的高表達能力。

免疫調節/抑制能力

6.11.1應高表達PGE2、IDO、KYN、COX-2、IL-10,TGF-β1、NO、HLA-G5、HLA-E、ICAM-1、VCAM1、

B7-H1、Hmox1、galectin-1、PD-L1和PD-L2；或其它標志性分子。

6.11.2應能分泌miR-146a-5p、miR-199a-5p、miR-133a-3p、和/或miR-181a。

6.11.3應能抑制樹突細胞的激活和成熟，抑制T/Th17和B細胞的增殖和分化，抑制NK細胞的激活

和細胞毒性，誘導Treg擴增。

6.11.4抑制NK細胞合成perforinandTNF-a，抑制B細胞合成Blimp-1和生產IgM、IgG、IgA。

血管再生能力

6.12.1應具有bFGF、HGF、MCP1、PIGF、Ang-1/2、angiostatin、TGF-b2、VEGF-D、GM-CSF、CXCL5和

IL-8的高表達能力。

6.12.2應具有miR-135b-5p,miR-499a-3、miR-132和miR-126或其它標志性分子的高表達能力。

組織再生和修復能力

DT-MSCs用于不同組織再生和修復時，應具有相應的標志分子的合成和分泌能力：

a)用于神經組織再生和修復，應表達BDNF、CNTF、VEGF、GDNF、FGF20、NGF、CD49d、miR-24、

miR-23a和miR-146a；miR-199a-3p、miR-145-5p、miR-21或其它標志性分子；

b)用于肺組織再生和修復，應分泌KGF、HGF，EGF、HO-1、NO、Ang-1、miR-451、miR-146a、

miR-10a-5p或其它標志性分子；

c)用于腎組織再生和修復，應分泌IGF-1、IGFR-1、GNDF、VEGF、IL10和miR-let7c、miR-21、

miR-145和miR-146a或其它標志性分子；

d)用于肝組織再生和修復，應分泌HGF、VEGF、IL-10、MMP9/13、MFGE-8、KGF、miR-1246、miR-

20a、miR-124或其它標志性分子；

e)用于心肌再生和修復，應分泌VEGF、HGF、Ang-I、FGF-b、G-CSF、miR-223和miR-1246；miR-

100-5p、miR-19a或其它標志性分子；

f)用于軟骨修復和再生，應分泌IL-10、TSG、PGE2、miR-181b、miR-140、miR-340-5p、miR-

29b-3p或其它標志性分子；

g)用于皮膚修復和再生，應分泌和KGF、TIMP,ICAM,collagens,elastin,laminin、HGF，miR-

100,miR-106a,miR-146a,miR-20a,miR-181a、miR-21-5p,miR-125b-5p或其它標志性分

子；

h)用于肌肉和肌腱組織再生和修復，應分泌miR-24,miR-29a、miR-27b、miR-199a-5p、miR-

21或其它標志性分子。

抗衰老能力

6.14.1應能分泌miR-17-5p、miR-21、miR-29a、miR-100-5p、miR-126-3p或其它標志性miRNA。

6.14.2抑制靶細胞合成SASP如IL-6,IL-6R,REL,IL-1β,REL-A,減少自由基和過氧化物，

保護線粒體的穩態，下調PTEN、p53、IGF-1R、p21和p16的表達，刺激生長因子如GDF11表達、延長

端粒和防止靶細胞的凋亡。

抗腫瘤能力

應能高表達和分泌標志性蛋白分子如：IL12,IFN-α,CXCL10,LAP,DKK-1/3,TRAIL,TNFSF14、

TIMP-1和TIMP-2。

7DT-MSCs的微生學和生物學安全性

安全性指標應符合表2要求。

表2安全性指標

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指標要求

微生物（細菌和真菌）不得檢出

支原體不得檢出

乙肝五項不得檢出

HCV不得檢出

TP不得檢出

傳染病原體HIV-I/II不得檢出

EBV不得檢出

HTLV不得檢出

CMV不得檢出

內毒素≤0.3EU/ml

成瘤性免疫缺陷小鼠體內注射3個月不可形成腫瘤

異常毒性試驗動物無肝腎毒性且不可死亡

異常免疫學反應淋巴細胞亞群CD4+/CD8+T和B應無異常增殖

外源DNA殘留量≤100pg

抗生素不得檢出

殘留物牛血清殘留不得檢出

動物源性胰蛋白酶殘留不得檢出

懸液磷酸鹽不得檢出

8標簽、包裝、儲存和運輸

標簽和編碼

8.1.1成體間充質干細胞制品外包裝標簽應當包含規格、細胞總量、適用范圍、制備日期及時間、有

效期、制品批次、制備機構等內容。

8.1.2異體間充質干細胞除標注上述內容外，還應標注細胞來源。

8.1.3MSCs制品的編碼中應體現該細胞的編碼信息，以便于溯源。

包裝

包裝材料應符合醫用回輸袋或硅化鍍膜塑料瓶等Ⅰ類醫療器材的要求。

儲存

8.3.1如需長期儲存，應放在低于-150oC的液氮環境中。

8.3.2細胞制品在使用前如需暫時存儲，應置于2℃～6℃下，時間不超過12小時。

運輸

8.4.1MSCs的運輸應有全過程的詳細記錄，包括產品信息、運輸條件、方式路徑、和時間人員等。

8.4.2應根據細胞制品的特性選用不易破損的防震保護箱。

8.4.3應采用冷鏈運輸，溫度保持在2℃～6℃。

8.4.4運輸時間不能超過12小時。

9檢測報告

用于疾病治療的間充質干細胞制品應隨附檢測合格報告，檢測報告內容應包括：

a)規格指標：細胞名稱、代次和總量，生產批號和日期；

b)生物學特性指標：細胞的形態和大小分布；細胞的活力；細胞表面標志物如CD44、CXCR4、CD73、

CD105、CD142、CD47、CD166、HLA-ABC和HLA-Dr；β-半乳糖苷酶、ROS和NPB；

c)適應癥相關的生物效力指標：3-5項；

d)安全指標：按照第7章要求執行。

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參考文獻

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