DB51DB51/T1546—2012植物檢疫實驗室常規檢驗技術真菌2012-12-20發布2013-03-01實施四川省質量技術監督局發布I前言 1 1 1 2 2 2 2 39結果判定 3附錄A(資料性附錄)真菌病害主要癥狀特征 4附錄B(資料性附錄)真菌病害顯微鏡檢查 6附錄C(資料性附錄)真菌病害染色檢驗 7附錄D(資料性附錄)真菌病害分離培養檢驗 8本標準按照GB/T1.1-2009給出的規則進行編寫。本標準由四川省農業廳提出并歸口。本標準由四川省質量技術監督局發布。本標準起草單位：四川省農業廳植物檢疫站。本標準主要起草人：寧紅、李小松、劉可、趙蘭鸰、帥波、黃玲、熊玉蘭、楊重渝、袁曦。12規范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569-2009農業植物調運檢疫規程3術語和定義3.1病原真菌plantpathogenicfungi植株受病原菌侵染后，內部生理活動和外觀上的生長發育呈現出某種異常狀態。3.3病征sign病原菌在植物受害部位產生的結構特征。3.4菌絲和菌絲體hyphaandmycelium真菌的典型營養體，通常呈絲狀，單根的叫菌絲，菌絲的集合體叫菌絲體。3.5子實體fruitbody真菌產生孢子的結構，如子囊果、擔子果、分生孢子器、分生孢子盤、子座等，統稱為子實體。3.7無性孢子asexualspore23.9柯赫氏法則Koch'sRule——乳酚油(苯酚結晶20mL,乳酸20mL,甘油40mL,蒸餾水20mL)——酒精(70%、95%)——龍膽紫(0.04%)——酒精冰醋酸混合液(95%酒精20mL,冰醋酸20mL)——苯胺藍水溶液(苯胺藍0.1g,蒸餾水100mL)—水合氯醛水溶液(水合氯醛5g,蒸餾水2mL)——升汞水溶液(升汞1g,濃鹽酸2.5mL,蒸餾水1000mL)——福爾馬林醋酸酒精固定液(FAA)(95%酒精20mL,福爾馬林5mL,冰醋酸5mL,蒸餾38檢測方法8.1癥狀觀察觀察樣品有無異樣，初步判斷是否具有真菌病害的表現特征(見附錄A),持擴大鏡觀察感病植株8.2顯微鏡檢查8.3染色檢驗8.4保濕培養切取的培養物放在玻棒上，置于25℃~28℃恒溫箱中培養一定時間，待培養物長出菌絲或子實體進行8.5分離培養見附錄D。將分離得到的純培養物制成孢子(或菌絲)懸浮液，通過噴霧、涂抹或針刺的方法將病原菌接種到相同品種的健株上，保濕約24h~48h,誘發寄主發病。然后再從接種發病的植株上再次分離得到其純9結果判定9.2根據染色檢驗、保濕培養或分離培養，鏡檢觀察病原菌的形態學特征，符合某種病害的病原菌特9.3采用柯赫氏法則判定，如寄主在接種后產生與原發病害一致的典型癥狀，并能從典型癥狀上再次分離到與接種物性狀一致的病原菌，根據病原菌形態學特征，可判定為該類病害。4(資料性附錄)真菌病害主要癥狀特征A.1白粉類花、果、葉及嫩枝上覆蓋白色粉狀物，后期在白粉物上出現散生狀針頭大的顆粒，顆粒由白變黃，最后變黑。A.2煤污葉、枝、果實表面覆蓋一層煤煙狀物，用手容易擦掉，這種病A.5白絹A.6斑點A.7炭疽A.8畸形植物受害部位變大或縮小，生長不勻，失去原來形狀，后期在受害部位出現病征。發生在枝干皮層，病斑形狀有圓形、近圓形、長形，通常病斑周圍稍隆起，中間組織死亡，下陷，干裂，后期常產生小黑點或盤狀物。5發生在喬灌木的枝干或根部木質部，使木質部變質、變色、腐朽，樹干內因木質部腐朽出現空洞，受害部位表面后期往往出現大型真菌繁殖體，如木耳、蘑菇或馬蹄狀等各種形狀繁殖體。分為濕腐和干腐。多汁部位破壞解體后產生濕腐或軟腐癥狀；含水量低的植物組織軟硬部位病死后產生的組織死亡稱為干腐，在枝干上常與潰瘍相似。A.12猝倒和立枯大多出現在播種育苗的苗木上。小幼苗根莖部發生腐爛使植物猝然倒伏，由于發生過程迅速，地上部分仍維持正常狀態，稱為猝倒；若幼苗根莖已木質化，莖部腐爛后不倒伏，地上葉子干枯，稱為立枯。6(資料性附錄)真菌病害顯微鏡檢查B.1菌絲體和子實體的挑取檢視顯微鏡下檢視，常用浮載劑有蒸餾水、乳酚油和甘油乳酸等。檢查葉片表面的真菌(如白粉菌、銹菌或其它霉菌等),采用粘貼檢視的方法。將小段透明膠帶粘貼在有真菌生長部位的葉面上，將膠帶取下放在載玻片上的一滴甘油乳酸中，上面再加一滴甘油乳酸，B.3組織整體透明檢視將小塊病組織放在等量的酒精冰醋酸混合液中固定24h,再浸在飽和的水合氯醛水溶液中，待組織透明后取出用水洗凈，經稀苯胺藍水溶液染色，用甘油乳酸作浮載劑鏡檢。B.4徒手切片鏡檢選擇軟硬適中的植物器官或組織為材料，直接切成長約2cm～3cm的小段，切片斷面不超過3mm2~5mm2。對于柔嫩的器官組織(如幼葉),可夾在通草、木髓和胡蘿卜中進行切片。切片前先準備好一個盛有清水的培養皿；切片時用左手的拇指、食指與中指捏住材料，使材料突右手將刀片平穩地放在左手食指上，刀口向內，與材料切面保持平行，再用右7(資料性附錄)C.1苯胺藍乳酚油染色法挑取少量菌絲置于載玻片上，用加有0.1%苯胺藍的乳酚油作浮載劑，將載玻片微微加熱，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察真菌孢子或菌絲隔膜。如果染色太深，可用未加染料的C.2龍膽紫染色法將病組織的徒手切片置于FAA固定液中固定染色25min~45min,用水沖洗后制片觀察。8D.1培養基制備D.1.1種類D.1.1.1清水培養基瓊膠15～20gD.1.1.2馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基葡萄糖(或蔗糖)10g瓊膠17～20gD.1.1.3燕麥片瓊膠培養基瓊膠17～20gD.1.2制備方法D.1.2.1清水培養基制備方法在1000mL沸水中，加瓊膠熔化后根據需要分裝滅菌保存。D.1.2.2馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基制備方法將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水1000mL煮沸半小時，用紗布濾去馬鈴薯，加水補足1000mL,然后加糖和瓊膠，加熱使瓊膠完全熔化后，趁熱用紗布過濾，根據需要分裝三角瓶或試管滅菌保存。D.1.2.3燕麥片瓊膠培養基制備方法將燕麥片加水1000mL,在沸水浴上加熱1h,紗布過濾后加水補足1000mL,加瓊膠熔化后根據需D.2分離培養檢測法D.2.1分離工作的準備打開超凈工作臺通風20min以上，用70%酒精擦拭手、臺面和工作臺出風口進行消毒，分離培養所需的用具用95%酒精擦拭后用火焰灼燒滅菌。9D.2.2.1葉斑病害——從病健交界處切取邊長約5mm的小塊病組織備用。D.2.2.2維管束組織病害D.2.2.3根腐病害——小材料可參照D.2.2.1,大材料可參照D.2.2.2。——多肉的根、莖和果實等可參照D.2.2.2。D.2.2.5種子病害——取整粒種子或種子的一部分備用。D.2.3平板的制作將培養基加熱融化，取出搖勻，在超凈工作臺上經無菌操作將培養基倒入已滅菌的培養皿中，厚度2mm~3mm,搖勻，靜置冷卻。可在10mL培養基中加入3滴25%乳酸，或加入40ug/mL鏈霉素防D.2.4分離培養D.2.4.1組織分離法將分離的材料置于已滅菌的培養皿內，先在70%酒精中浸2s~3s,再放入0.1%升汞溶液處理30s~10min(根據材料大小、堅實程度不同有所差異),再用滅菌水清洗3～4次，用滅菌濾紙吸干材料上的D.2.4.2稀釋分離法此方法適