ICS67.050X04DB22DB22/T1828—2013球菌的多重PCR檢測DetectionofSalmonella,ShigellaandStaphylococcusaureusinagriculturalproductsbymultiplexPCRmethod2013-05-15發布2013-09-01實施吉林省質量技術監督局發布IDB22/T1828—2013本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規則起草。本標準由吉林省質量技術監督局提出并歸口。本標準起草單位：吉林省產品質量監督檢驗院、吉林農業大學。本標準主要起草人：邴煒、陳萍、史艷宇、李月紅、任常菲、王秀娟、崔敬愛。1DB22/T1828—2013本標準規定了農產品中沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌核酸的多重PCR檢測方法。本標準適用于農產品中沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的快速篩選檢測。本標準不適合仲裁檢驗。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.4食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗GB4789.5食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗GB4789.10食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈式反應（PCR）技術的應用3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1多重聚合酶鏈式反應（多重PCR）multiplepolymerasechainreaction多重PCR又稱多重引物PCR，是在同一PCR反應體系中加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。4縮略語下列縮略語適用于本標準。invA基因：侵襲蛋白基因（invasionproteinAgene）nuc基因：耐熱核酸酶基因（thermo-stablenucleasegene）ipaH基因：侵襲性質粒抗原基因（invasiveplasmidantigenHgene）除特別說明以外，所用試劑為分析純或生化試劑。2DB22/T1828—20135.1水：應符合GB/T6682中一級水的規格。5.2緩沖蛋白胨水（BPW）：按GB4789.4規定。5.37.5%氯化鈉增菌肉湯：按GB4789.10規定。5.4志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素：按GB4789.5規定。5.5引物：見表1。致病菌名稱靶基因上下游引物序列產物長度/bp終濃度/(mmol/L)沙門氏菌invA2554040金黃色葡萄球菌nuc5’-GCTCAGCAAATGCATCACAAAC-5065’-AGCGTTGTCTTCCGCTCCAAA-3’志賀氏菌ipaH5’-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3’6205’-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3’5.6細菌基因組DNA提取試劑盒。5.710×PCR緩沖液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化鉀，20mmol/L氯化鎂。5.8dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。5.9TaqDNA聚合酶。5.10分子量標記：100bpDNAMarker。5.11瓊脂糖：電泳純。5.12溴化乙錠。5.1350×TAE電泳緩沖液（儲備液稱取484gTris，量取114mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用前稀釋成1×TAE電泳緩沖液（工作液）。5.146×加樣緩沖液：30mmol/LEDTA、36%（體積分數）甘油、0.05%（質量濃度）二甲苯腈藍FF、0.05%（質量濃度）溴酚藍。5.15陽性質控菌株：來源于正規菌種保藏機構的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌標準菌株。5.16陰性質控菌株：來源于正規菌種保藏機構的任何非目標菌株。6設備和材料6.1天平：感量0.001g。6.2生物安全柜：AII型。6.3厭氧培養系統。↓↓↓↓3DB22/T1828—20136.5高壓滅菌器。6.6均質器或滅菌研缽。6.7高速冷凍離心機：12000r/min以上。6.8紫外分光光度計或核酸蛋白分析儀。6.9PCR儀。6.10電泳裝置。6.11凝膠成像分析系統。6.12微量移液器：0.2μL~2μL、2μL~10μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。6.13離心管：1.5mL、2mL。7檢驗程序沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢驗程序見圖1。樣品制備增菌培養DNA提取多重PCR擴增電泳及結果觀察↓↓確證試驗報告圖1PCR方法檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌程序圖4DB22/T1828—20138生物安全措施為了保護實驗室人員的安全，應由具備資格的工作人員操作，所有培養物應小心處置。應按照GB19489的規定執行。9廢棄物處理和防止污染的措施9.1檢驗過程中的廢棄物需經121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。9.2檢驗過程中防止交叉污染的措施按WS/T230執行。10.1樣品制備、增菌培養分別參照GB4789.4、GB4789.5和GB4789.10進行。10.2DNA的提取對于10.1培養的增菌液，各取0.5mL加到一個2mL無菌離心管中，12000r/min離心2min，盡量棄去上清液，使用細菌基因組DNA提取試劑盒并按其說明提取制備模板DNA。如不能及時檢驗，提取的DNA溶液可于-20℃保存。10.3DNA濃度測定采用紫外分光光度法測定DNA，所測得OD值為核酸總量。紫外分光光度法檢測核酸濃度的最佳范圍是2μg/mL~50μg/mL，值應該在0.05~1的區間內。將DNA溶液做適當的稀釋，放入紫外分光光度計的比色皿中，于260nm處測定其吸收值，1OD260nm=50μg/mL雙鏈DNA或38μg/mL單鏈DNA。PCR級DNA溶液的OD260nm/OD280nm比值為1.7~2.0。10.4.1空白對照、陰性對照和陽性對照試驗檢驗過程中分別設空白對照、陰性對照、陽性對照。空白對照設為以水代替DNA模板；陰性對照采用非目標菌的DNA作為PCR反應的模板；陽性對照分別采用沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株DNA模板來作為陽性對照。10.4.2反應體系PCR反應體系各成分的組成：10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5μL，dNTP（10mmol/L）2.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)1.5μL，DNA模板（100ng/μL)2μL，混合引物3.0μL（invA、ipaH和nuc的上下游引物分別加入0.5μL補充滅菌超純水至總體積25μL。10.4.3反應條件結束反應，4℃保存。10.4.4擴增產物電泳檢測5DB22/T1828—2013用電泳緩沖液（1×TAE）制備1.5%~2%瓊脂糖凝膠（55℃~60℃時加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/mL）。取8μL-15μLPCR擴增產物，分別和2μL上樣緩沖液混合，進行點樣，用DNAMarker作參照。3V/cm~5V/cm恒壓電泳，電泳20min~40min，電泳檢測結果用凝膠成像分析系統記錄并保存。11結果判定11.1若樣品PCR擴增產物電泳出現255bp（invA基因片段）、506bp（nuc基因片段）和620bp（ipaH基因片段）的任一擴增條帶或三者均出現，同時陽性對照擴增產物電泳后出現目的條帶（255bp、506bp和620bp同時出現），陰性對照和空白對照擴增產物電泳后沒有出現目的片段，判定結果可疑陽性。11.2PCR擴增產