間接免疫熒光法

檢測抗核抗體（ANA）制作人：XXX20XX-XX-XX間接免疫熒光法測ANA抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細胞核成分（DNA，RNA，蛋白質和酶）的抗體。ANA存在一個譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內比核質內更豐富間接免疫熒光法測ANAANA檢測的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標記抗體；

抗ScL-70是SD的標記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標記抗體；觀察疾病活動度和治療反應研究發病機理間接免疫熒光法測ANA【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）間接免疫熒光法測ANA幾種ENA的由來及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma間接免疫熒光法測ANA【ANA由來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補體均質體LE細胞LE細胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結締組織病，藥物過敏，慢活肝等亦可陽性。抗DNP取代LE細胞的檢測+間接免疫熒光法測ANAANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體間接免疫熒光法測ANAANA的篩選：間接免疫熒光法間接免疫熒光法測ANA實驗原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應；隨后，結合抗體可與標記熒光的二抗進行反應，并可在熒光顯微鏡下觀察。間接免疫熒光法測ANA抗原人特異性抗體FITC標記的抗人抗體FITC

FITC載片實驗原理：間接免疫熒光法測ANA生物薄片馬賽克TM技術間接免疫熒光法測ANA【實驗步驟】間接免疫熒光法測ANA實驗步驟一：準備檢查加樣板是否反應區親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時。只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟二：樣品準備1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟三：加樣在加樣板的每個反應區加入稀釋血清，避免產生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應區(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽性對照陰性對照間接免疫熒光法測ANA實驗步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟五：沖洗

用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟六：加樣

將20μl熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個反應區。完全加完所有的二抗后，方可繼續溫育（最多可加50個載片）。建議使用連續加樣器。加樣前應使用加樣器混勻。為節約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結合物至另一個加樣板的反應區中。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質，不要擦拭反應區的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續下一張。從現在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。可在每150ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍進行復染。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟九：封片

在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應區(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區間隙。將載片的生物薄片朝下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調整位置，正確放置。然后再進行下一個載片的操作。間接免疫熒光法測ANA實驗步驟十：結果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。間接免疫熒光法測ANA結果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細胞核發黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發熒光為陰性。抗原片中出現陽性染色細胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。間接免疫熒光法測ANA【均質型】

細胞核呈均勻一致的熒光

間接免疫熒光法測ANA【核仁型】

核仁部分呈現熒光間接免疫熒光法測ANA【斑點型】(顆粒型)

細胞核內呈現斑點狀熒光間接免疫熒光法測ANA【胞漿型】間接免疫熒光法測ANA【著絲點型】間接免疫熒光法測ANA

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型間接免疫熒光法測ANAANA結果判斷1：100陰性陰性，標本中未檢測到抗核抗體1：100陽性微量對于核均質性、著絲點、核點型等熒光模式，提示某種風濕性疾病或其他疾病1：320陽性陽性提示某種風濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應的最高稀釋度間接免疫熒光法測ANA【臨床意義】總的ANA檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一個極為重要的篩選試驗。絕大多數自身免疫性疾病均可呈陽性。ANA陽性者進一步檢測各亞類ANA抗體對明確診斷、臨床分型、病情觀察、預后及治療評價有重要意義。未經治療的、活動性SLE的陽性率為80%－100%。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混合性結綈組織病、狼瘡性肝炎、原發性膽汁性肝硬化等。干燥綜合癥（SS）、類風關、橋本甲狀腺炎等。間接免疫熒光法測ANA活動性SLE

（95-100%）非活動性SLE

（80-100%）藥物誘導的紅斑狼瘡 （100%）混合結締組織病 （100%）類風濕關節炎 （20-40%）其他風濕性疾病 （20-50%）進行性系統硬化癥