Q/LB.□XXXXX-XXXX百香果品種鑒定技術規程SSR分子標記法范圍本文件規定了利用簡單重復序列（SSR）分子標記進行百香果品種鑒定的操作程序、數據記錄與統計、判定方法。本文件適用于百香果品種SSR指紋數據采集及品種真實性鑒定。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法NY/T2517植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南西番蓮NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標記法總則術語和定義下列術語和定義適用于本文件。推薦引物recommendedprimer品種鑒定中優先選用一套簡單重復序列（SSR）引物，其檢測位點具有多態性高、重復性好等綜合特性。對照品種controlvariety對照品種具有所用SSR位點上不同等位變異的特性。對照品種用于輔助確定待測樣品的等位變異，校正儀器設備的系統誤差。原理不同品種百香果的遺傳組成不同，其基因組（DNA）中SSR的重復次數存在差異，根據SSR的差異，通過PCR擴增及電泳技術可以鑒定百香果品種。材料和試劑除另有說明外，本標準中使用分析純（含）以上試劑，水為符合GB/T6682規定的二級水，其中PCR用水要求達到一級水指標。試劑三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：純度＞99%。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)：純度≥99.0%。硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm3，含量≥99.5%。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：ρ=1.32g/mL，純度≥99.0%。氯化鈉（NaCl）：ρ=2.165g/cm3，含量≥99.5%。瓊脂糖。過硫酸銨（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm3，含量≥98.0%。氫氧化鈉(NaOH）：ρ=2.13g/cm3，含量≥96.0%。硝酸銀（AgNO3）：ρ=4.35g/cm3，含量≥98.0%。甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm3。液氮（N2）：ρ=0.81g/cm3。三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm3。無水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm3，含量≥99.7%。DNA分析儀用LIZ500分子量內標。去離子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。DNA分子量標準（DNAmarker）：可以清楚區分50bp～500bp的DNA片段。2×TaqPlusPCR預混試劑：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μmol/LdNTPeach、20mmol/LTris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mMMgCl2、穩定劑、增強劑。溶液配制5×TBE緩沖液稱取5.4g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）和2.75g硼酸（5.1.3）溶于70mL純水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。0.5×TBE緩沖液量取100mL濃度5×TBE（5.2.1）緩沖液于燒杯中，加入900mL純水混勻。CTAB提取溶液稱取4g十六烷基三甲基溴化銨（5.1.4）、16.38g氯化鈉（5.1.5）、1.21g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、1.49g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）溶于70mL純水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。無菌純水純水在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。1%瓊脂糖溶液1g瓊脂糖（5.1.6）溶于100mL的0.5×TBE緩沖液（5.2.2），適當加熱融化。10%過硫酸銨溶液稱取10g過硫酸銨（5.1.7），加入100mL純水溶解。電泳緩沖液稱取108g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）、55g硼酸（5.1.3）、0.8g氫氧化鈉（5.1.8），加入10L純水溶解。染色液稱取0.2g硝酸銀（5.1.9），加入400mL純水溶解。顯色液稱取4g氫氧化鈉（5.1.8），加入400mL純水溶解，臨用時再加1.6mL甲醛（5.1.10）。儀器和設備電子天平：感量為1mg。水浴鍋。高速冷凍離心機。PCR擴增儀。垂直板電泳系統。凝膠成像系統。毛細管電泳儀。膠片觀察燈。SSR引物序列信息引物序列信息見附錄A。操作步驟樣品采集用不銹鋼剪刀采集種植的已知品種的百香果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標識，放入0-8℃保溫箱中，帶回實驗室，于-18℃冰箱中保存備用。DNA的提取取8.1中適量百香果葉片用自來水沖洗干凈，再用純水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼剪刀剪碎放入研缽中，加入液氮（5.1.11）研磨成粉末狀，分取100mg放入1.5mL離心管中，加入750μLCTAB提取溶液（5.2.3），渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min~60min，期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500μL的三氯甲烷（5.1.12），顛倒混勻，12000rpm離心3min，轉移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等體積（即0.5mL）預冷至約4℃的無水乙醇（5.1.13），顛倒混勻，-18℃冰箱下靜置1h，12000rpm離心3min，去上清液，室溫下干燥沉淀。加入50μL無菌純水（5.2.4）于-18℃冰箱中保存備用。以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達到PCR擴增質量要求的DNA提取方法也適用于本規程。PCR擴增PCR反應體系PCR反應體系見表1。PCR反應體系試劑終濃度體積滅菌純水-8.5μL2×TaqTaqPlusPCR預混試劑1×12.5μL10μmol/L正向引物0.4μmol/L1.0μL10μmol/L反向引物0.4μmol/L1.0μL25ng/μLDNA模板2.0ng/μL2.0μL總體積25.0μLPCR反應程序94℃預變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度見附錄A推薦引物表），72℃延伸30s，35個循環；最后72℃下延伸7min。PCR產物檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測聚丙烯酰胺凝膠制備在一對玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1%瓊脂糖溶液（5.2.5），讓其凝固密封。在50mL量杯中依次加入7.5mL5×TBE緩沖液（5.2.1），7.5mL40%Acryl/BisSolution(29:1)（5.1.16），攪拌并用純凈水定容至30mL；加入200μL10%過硫酸銨（5.2.6）和12μL四甲基乙二胺溶液（5.1.17），混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在50min~60min內聚合凝固，凝膠高度應不小于10cm。電泳將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液（5.2.7），小心拔下樣品梳。用加樣器吸取1μL不同引物（附錄A）PCR產物，加入樣品孔中，同時在同一塊膠中加入1μLDNAmarker（5.1.18）。電泳選用的電壓梯度為1~5V/cm，2×TaqPlus預混試劑（5.1.19）的藍色指示帶從上到下分別到達膠板1/2、2/3處（大約1h）后結束電泳。銀染顯色將附著凝膠的玻璃板用去離子水沖洗30s~60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤中，加入染色液（5.2.8）覆蓋凝膠，輕搖5min~10min進行染色；倒掉染色液，用去離子水快速漂洗，放入顯色液（5.2.9）中，輕搖至顯色出清晰帶紋；取出凝膠用純水沖洗兩遍，瀝干后進行拍照。毛細管電泳檢測PCR產物樣品準備分別取等體積的稀釋后不同引物（附錄A）PCR擴增產物溶液混合，從混合液中吸取1μL按序號加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別再加入0.1μLDNALIZ500分子量內標（5.1.14）和8.9μL去離子甲酰胺（5.1.15）。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，迅速置于碎冰塊上，冷卻10-15min。將整個96孔板置于離心機中，離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。電泳檢測按照儀器操作規程，編輯樣品表及運行程序，執行運行程序，儀器自動給出檢測結果，保存并記錄數據。數據記錄與統計樣品每個SSR位點等位變異采用擴增片段長度表示；對于毛細管電泳檢測方法，使用對照品種消除DNA分析儀間可能存在的系統誤差，使用片段分析軟件讀取位點等位變異。對于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，將待檢樣品與對照品種的等位變異片段進行比較，明確待檢樣品位點等位變異。純合位點結合等位變異大小數據記為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異大小數據記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點上的2個等位變異的大小，小片段數據在前、大片段數據在后；缺失位點的等位變異大小數據記錄為0/0。樣品在某個位點上僅出現1個等位變異，大小為160bp，則該位點的等位變異數據記錄為160/160。樣品在某個位點上僅出現2個等位變異，大小為160bp、165bp，則該位點的等位變異數據記錄為160/165。判定方法當待檢樣品和對照品種間差異位點數≥2，則判定為“不同品種”；當待檢樣品和對照品種間差異位點數=1，判定為“近似品種”；當樣品間差異位點數=0，判定為“極近似品種或相同品種”。

（規范性）

推薦引物推薦引物見表A.1引物編號及引物擴增信息序號引物名稱條帶大小（bp）引物退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）1PeRM1000195-10750正向：GCATGGACTTGATTTGTATATTCT反向：GAGAACAATGATGTCACTTTCATA2PeRM1000598-14050正向：TAGTGACATAACTGAAAACGCTAT反向：GAGTTACCGCTGAAGTTTTCTA3PeRM10006149-19050正向：TCATTAACATCGTAAACAAAGATT反向：AATTCGACAAGATTTACTGATACA4PeRM1000795-10650正向：GTAGTAGGAGAATATTTGAGGGAA反向：CTATTTTGTGATCCAAGGAAGT5PeRM10008105-12350正向：GTCACTATCATCCCATAAAAATTC反向：AGGTAAAATTAATATGATAAGCGAA6PeRM10009135-14550正向：GATTGATTTGTGGATGGATACT反向：CACTTGTTTCACTCGTACAATAAT7PeRM10011120-13010955正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’反向：AGAGATATTTTTCACTCACTGGAT8PeRM10012135-18015150正向：CTCCATATCAGATTAAGTAACCAC反向：CTCAAATAAAAACAAACCTGTTAC9PeRM10014130-14050正向：CATTTATAAAGGAATTGACAAGAA反向：CTGAGTTAATGCTGTGATTAAGAT10PeRM1001614950正向：AATTTTCTTGGCTTAAAACACTAC反向：TTGACTTCACTGCTATGGTATTAG11PeRM10017146-17650正向：AAGACACTGATAGTTCTCTGAGG反向：CAAATTATGATAAGAAACTTGGAA12PeRM10018160-17050正向：ACAGAAAAGAAAGATAAAGCAAAT反向：TTCAGTATCCAACTGAACACAC13PeRM10019142-15050正向：TGGTAGTCAATCAGAAAACTAAGA反向：GAGTTGTTAGGTCTCCTCAACTTA14PeRM10020132-14250正向：AACAGGGTATACTGTAAATCATTG反向：GTTTATTCCTTTCTCTTCTAGTGC15Pa_F-P10A1022050正向：TGGAATGTGATTTGCATGG反向：TAGGTATTGCTGGCGAAG16Pa_F+R-Contig11429050正向：CTTGCCTCTCTCCCTCTC反向：GGGTTTTGGGTTTGACAG表A.1引物編號及引物擴增信息（續）序號引物名稱條帶大小（bp）引物退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）17Pa_F-Contig1329350正向：CAGAAGGAAAACCAGCAAG反向：CCCCATCATCATCACTTTC18Pa_F-P7E10240-25550正向：TTAATGCCACAGCCCAAC反向：TGACCCAAAATCAAACACC19Pa_F+R-Contig80360-38055正向：TGTTCAAGCCCATCTTCG反向：GCTCTCGCTCTTGTCGTAG20Pa_F-P6H04280-29555正向：GAATAGGGTCAGCAGGAGG反向：GAGTGTGTCATCGGAGTCC21PE222353正向：GATCGGTCCTCGGTTAGAC反向：AGTCACACAGCATGAGAAATC22PE625853正向：GCAATTTCACCATCTTCTGCT反向：CCACGGTCATGGATGTTC