學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精庖丁巧解牛知識·巧學一、限制性核酸內切酶--“分子手術刀”基因工程的“分子手術刀”指的是DNA限制性核酸內切酶（以下簡稱限制酶).限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定部分的兩個核苷酸之間“切割”DNA分子。例如，從大腸桿菌中發現的一種限制酶只能識別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。目前已經發現了二百多種限制酶，它們的切點各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因就能被某種限制酶切割下來。疑點突破限制性內切酶識別序列和切開部位有何特點?限制酶所識別的序列,大多數是由6個核苷酸組成，也有少數識別序列由4、5或8個核苷酸組成,但都可以找到一條中軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的；任何一種限制酶因其本身性質所決定，都只識別和切斷特定的核苷酸序列,而不是在任何部位都能將DNA切開.要點提示當限制酶在它識別序列的中軸線兩側將DNA兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端；在中軸線處切開時，產生的是平末端。二、DNA連接酶—-“分子縫合針"被限制酶切開的黏性末端，帶有幾個伸出的核苷酸,它們之間正好互補配對.可以設想,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，然后讓兩者的黏性末端黏合起來,似乎就可以合成重組的DNA分子了。但是，實際上僅僅這樣做是不夠的，互補的堿基處雖然連接起來，但是這種連接只相當于把斷成兩截的梯子中間的踏板連接起來,兩邊扶手的斷口處還沒有連接起來。要把扶手的斷口處連接起來,也就是把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來,還要靠另一種極其重要的工具-—DNA連接酶。辨析比較DNA連接酶和DNA聚合酶有何異同點？相同點:兩者都是催化形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成);都由蛋白質構成。不同點：(1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，也不是連接互補堿基之間的氫鍵.（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上（不能連接單鏈DNA）的兩個缺口同時連接起來。因此，DNA連接酶不需要模板。三、基因進入受體細胞的載體-—“分子運輸車"要將一個外源基因送入受體細胞，還需要有運輸工具，這就是運載體。作為運載體的物質必須具備以下條件：能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存；具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選.目前，符合上述條件并經常使用的運載體有質粒、噬菌體和動植物病毒等。質粒是基因工程最常用的運載體，它廣泛地存在于細菌中,是細菌染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子，大小只有普通細菌染色體DNA的百分之一。質粒能夠“友好”地“借居"在宿主細胞中.一般來說，質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。但是，質粒的復制則只能在宿主細胞內完成.大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌等細菌中都有質粒。因為土壤農桿菌很容易感染植物細胞，所以科學家培育轉基因植物時，常常用土壤農桿菌中的質粒作運載體。難點剖析作為基因工程中的“分子運輸車”—-載體，應具備以下條件：(1）必須有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上;（2）載體必須具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制；（3）必須帶有標記基因，以便進行重組后的篩選;（4）必須是安全的,不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去；（5）大小應合適，太大則不易操作。問題·探究問題1如何準確理解基因工程的含義？探究:(1)它是一種按照人們的意愿，定向改造生物遺傳特性的技術；（2）在DNA分子水平進行操作；(3)是體外進行的人為的基因重組；（4）一旦成功，便可遺傳；（5)主要技術為體外DNA重組技術和轉基因技術。問題2基因操作過程中，只用到限制性內切酶和DNA連接酶嗎?探究:在基因操作過程中，除了以上兩種酶以外，還要用一系列其他酶類,才能完成全過程。例如，堿性磷酸酯酶、末端轉移酶、逆轉錄酶等，這些酶都有各自特殊的功能，可以根據不同的需要選用。任何一種限制酶都只識別和切斷特定的核苷酸序列,這是由限制酶的性質所決定的。DNA連接酶是將一段DNA片段3′端的羥基與另一DNA片段5′端磷酸基團上的羥基連接起來形成酯鍵,而不是連接互補堿基之間的氫鍵.典題·熱題例1下列有關基因工程的敘述，不正確的是(）A.基因工程又叫做重組DNA技術B。對生物的基因進行改造或重新組合,定向改造生物的遺傳性狀C。在醫藥衛生、農牧業和環境保護等方面有廣泛的應用D。可對任何物種進行改造，控制生物的進化解析：基因工程又叫重組DNA技術或基因拼接技術,可以定向地改造生物的遺傳性狀,但是無法改造物種，更不可能控制生物的進化。答案：D誤區警示基因工程可以對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出人類所需要的基因產物。但是無法改造物種，更不可能控制生物的進化,不能人為地夸大基因工程的作用。例2下列關于限制酶的說法，正確的是(）A。限制酶廣泛存在于各種生物中,微生物中很少分布B。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列C。不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端D。限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵解析:此題主要考查限制酶的有關知識.限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的，并不是廣泛存在于各種生物中；一種限制酶能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開；DNA分子經限制酶切割會形成黏性末端和平齊末端兩種。答案：B例3下列有關質粒的敘述，正確的是()A.質粒是廣泛存在于細菌細胞中的一種顆粒狀的細胞器B。質粒是細菌細胞中能自主復制的小型環狀DNA分子C。質粒只有在侵入宿主細胞后才能復制D.細菌質粒的復制過程一定是在宿主細胞外獨立進行的解析:質粒是一個小型的環狀DNA分子,它可以進入細菌細胞,存在于細胞內，但它不是宿主細胞的細胞器。質粒是一個重要的運載體，通常利用質粒與目的基因結合，形成重組質粒，而后導入細菌細胞.答案：B拓展延伸作為載體必須具備三個條件：（1）能在宿主細胞內穩定保存并大量復制;(2)有多個限制酶切點，以便與外源基因連接;（3)具有某些標記基因，以便進行篩選。質粒具備以上三個條件，且是基因工程中最常用的運載體。例4關于質粒和染色體的敘述，正確的是（）A。兩者有相同的化學本質B。兩者是同一物質的不同形態C。質粒不存在于真核細胞中，染色體普遍存在于真核細胞中D。兩者的化學成分中均含有脫氧核糖解析：質粒是存在于細菌、酵母菌等微生物細胞中的小型環狀DNA分子，染色體是真核生物細胞核中主要由DNA和蛋白質組成的物質。答案：D例5下列關于基因工程的敘述，正確的是（）A.基因工程經常以抗菌素抗性基因為目的基因B.細菌質粒是基因工程常用的運載體C。通常用一種限制性內切酶處理含目的基因的DNA,用另一種處理載體DNAD.為育成抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體解