Word1/1真核細胞rna提取的實驗報告范文篇二：真核細胞RNA的提取

RNA是基因表達產物，由以下幾類分子組成，rRNA（占細胞總RNA的80%～85%）、tRNA和核內小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物學的主要討論對象，分別制備mRNA是克隆基因，分析基因表達以及建立cDNA文庫的首要步驟。

真核細胞總RNA分別提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分別的關鍵是盡量削減RNA酶的污染。RNA酶活性特別穩定，分布廣泛，除細胞內源性的RNA酶外，環境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時，應盡量制造一個無RNA酶的環境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內源性RNA酶活性。主要是采納RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強力的蛋白質變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內源性RNA酶，采納焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取的關鍵

真核細胞RNA的提取過程有四個關鍵點，即①樣品（細胞或組織）的有效破裂；②有效地使核蛋白復合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分別；其中最關鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。

二、組織RNA提取的基本步驟

1.儀器：勻漿器、低溫離心機、離心管。

2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧

化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液。

3.主要步驟

（1）取組織50~100mg，加0.8mlTrizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。

氯仿，充分震蕩混勻，靜置

0.5ml異丙醇，顛倒混勻。－

1ml75%乙醇溶液，漂洗沉

淀，

10min。

lDEPC溶液，充分溶解RNA

RNA溶解液，按肯定比例稀釋后，紫外分光光度計測

值，計算OD260/OD280

OD260＝1時，RNA濃度約為

）＝OD260×稀釋倍數×40

1%甲醛變性膠電泳觀看

甲醛變性凝膠板：4.5μlRNA，120xxg×℃靜置2h，4℃1.7~2.0，依據下述公式計算×甲醛膠電泳緩沖液，離心。棄沉淀。×10min×5min離心。：1之間，說明RNA濃度：3%過氧化3.5μl37%甲（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，120xxg離心。（4）棄上清，取沉淀，加入，7500g（5）棄上清，沉淀真空干燥（6）加40μ。4.結果鑒定（1）紫外分光光度計檢測：取定260nm、280nmOD比值，假如比值在RNA純度可。標準樣品當40μg/mlRNA濃度（μg/ml。（2）電泳檢測：RNA質量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制1%，2ul5

醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65℃變性15min后，快速置冰浴中；再加入2μlRNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳1～2h；暗室內紫外光下觀看，拍照；假如觀看到清楚的18S、28SRNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品－70℃保存備用。

三、留意事項

1、全部玻璃器皿160～180℃高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經0.1%DEPC液浸泡后，經高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。

2、試驗用水要經DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。

3、試驗操作過程中要戴一次性手套，以避開RNA酶污染。

藥大0942605

篇三：真核細胞rna提取

試驗原理：

依據成熟雌蟾蜍體內含大量卵細胞且可以便利獵取，細胞內含核酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優點以確定蟾蜍卵細胞為試驗所需的真核細胞。通過TRIZOL溶液中變性劑破裂真核細胞，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再利用RNA不溶于異丙醇的性質將自身析出，達到分別提純的目的。

TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯合使用可增加抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消逝，導致細胞結構降解，核蛋白快速與核酸分別。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

甲基綠—吡羅紅為堿性染料，它分別能與細胞內的DNA、RNA結合呈現不同顏色。當甲基綠與吡羅紅作為混合染料時，甲基綠與染色質中DNA選擇性結合顯示綠色或藍色；吡羅紅與核仁、細胞質中的RNA選擇性結合顯示紅色。其緣由可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結合呈現綠色。而吡羅紅則與聚合程度較低的RNA結合呈現紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結合呈現紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。09419

試驗材料：

（一）試劑

1.甲基綠—吡羅紅染料：①染色劑A液的兩種配制方法

第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉1g，加入到100mL蒸餾水中溶解，然后用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。

其次種方法：取甲基綠2g溶于98mL蒸餾水中，取吡羅紅G5g溶于95mL蒸餾水中。取6mL甲基綠溶液和2mL吡羅紅溶液加入到16mL蒸餾水中，即為A液，放入棕色瓶中備用。（留意：用于核酸染色的是吡羅紅G，請不要錯買吡羅紅B。）

②染色劑B液的配制方法B液是一種緩沖液，由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000mL備用；再取乙酸12mL，用蒸餾水稀釋至1000mL備用。取配好的乙酸鈉溶液30mL和稀釋的乙酸20mL，加蒸餾水50mL，配成pH為4.8的B液（緩沖液）。

③染色劑的配制染色劑是由A液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是試驗中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應當留意的是該試劑應現配現用。

2.TRIZOL試劑（Invitrogen公司購買）

3.75%乙醇

4.氯仿

5.異丙醇

6.Nacl(0.14m/l)

（二）器材

1.離心機（3000r.p.m）

2.冰浴

3．研缽

4.燒杯

5.量筒

6.試管

7.玻棒

8.膠頭滴管9

9.離心管

10.天平

試驗方法：

制備勻漿：

以班級為單位，稱取也許10g蟾蜍卵細胞（2~3℃保存），于研缽（可置于冰浴鍋上）中，依據10~30mg組織細胞加1mltrizol試劑的量加入其中，快速研磨，制備勻漿。試驗二人合作為一組，每組取也許10ml勻漿。

RNA的提取：

取回勻漿后，室溫靜置10min，使樣品充分裂解——離心(3000r.p.s)20mins——取上清液移至新的離心管——加1/5TRIZOL溶液體積氯仿——在手中反復振蕩搖勻，室溫靜置10min。——離心20mins——取上清液——在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10min。——充分混勻，靜置10minute——離心20min——沉淀用75%乙醇洗滌兩次

定性試驗：

取2支潔凈試管，一管加入1.5MLRNA溶液（將RNA顆粒狀的沉淀溶于

2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸餾水1.5ML,像兩管中加入3M甲基綠-吡羅紅染色劑，溶液變成紅色為陽性反應。

試驗結果：