專題突破10綜合PCR的基因工程問題

一、選擇題

1.（2024.廈門高三質檢）如圖表示PCR過程中某個階段反應體系的情況，①②③④表示相關

物質，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）

"斑...

L5避33喳5'R

.......

A.②鏈從L到R的方向為3'-5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板

B.PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復制

C.以1個DNA為模板經3次循環需消耗8個引物③

D.物質③的5,端添加了某序列，至少需經2次循環才可獲得該序列的雙鏈產物

2.（2024?重慶高三質檢）不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產生大量單鏈DNA（ssDNA）

的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較

多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1：100,PCR反應最初的若干次循環中，其擴

增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA）,但當限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA。下列

相關說法錯誤的是（）

甲F11111

也”限制性引物

甲^tlltlllll1

/r,___-_1___

A.用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列

B.進行最初若干次循環的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致

D.因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離

3.（2024?無錫高三模擬）重疊延伸PCR可實現定點基因誘變，其操作過程如圖所示（凸起處代

表突變位點）。下列說法正確的是（）

通用引物FP1突變引物FP2

突變引物RP1I通用引物RP2

①3

第1對引物

公的PCR產物

第對引物

2重疊區域

的PCR產物

②混合、變性、復性

3'5'?3'

3,一X5'

③延伸

通用引物FP]

先

L通麗物RP2

PCR1④

突變的基因

A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率

B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產物

C.過程②的產物都可以完成延伸過程

D.若過程④得到16個突變基因則需要消耗15個通用引物RP2

4.反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列（圖中L、R）進行擴增的技術，其過程

如圖所示。下列相關敘述不正確的是（）

,已知序列口

51L?尸，3,

酶切位點酶切位點

,①酹切「

環化并加入根據已

知序列合成的引物

R

③PCR擴增

L1R

「IIJ

已知序列已知序列

A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割

B.過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵

C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術可檢測T—DNA整合到植物染色體DNA的位置

5.IKK激酶參與動物體內免疫細胞的分化。臨床上發現某重癥聯合免疫缺陷（SCID）患兒的

的0基因編碼區第1183位堿基T突變為C。為研究該患兒發病機制，研究人員應用大引物

PCR定點誘變技術獲得突變基因，如圖所示。下列說法錯誤的是（）

引物

/KK/3基因I11111

!!!!!!

PCR.-T—J-5f

引物山磯」

c.大引物a鏈

“大弓i物b鏈

G

/KK0基因

5'_____3Z

PCR2T?5'

引物C一一大引物a鏈

G大引物b鏈

SacI

G3

5'L——

c

Gindin

注：定點誘變獲得突變基因的過程，需要以下

3種引物：

引物A:5Z—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—3r

、突變堿基

引物B:5y—TAAGCTTCGAACATCCTA—3Z

識別序列

引物C:5Z—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3(

SacI識別序列

A.PCRi中使用的引物有引物A、引物C

B.PCR2中使用的引物有引物3、大引物b鏈

C.PCRi過程需要擴增3輪才能獲得目標產物

D.PCR2過程中，為減少錯誤DNA片段的產生可適當升高復性溫度

6.（2024?安順高三調研）熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其

原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當耐高溫的

DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監測系統接收到熒光信號，即每擴增

一次，就有一個熒光分子生成（如圖）。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（熒光信號達到

設定閾值時所經歷的循環次數）。下列相關敘述錯誤的是（）

熒光探針

A.PCR每個循環包括變性、復性（引物和模板結合）、延伸3個階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應中的作用是形成磷酸二酯鍵

C.最終監測的熒光強度與起始時反應管內樣本DNA的含量呈正相關

D.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數目越多，患者危險性更高

7.（2024?襄陽高三模擬）通過設計引物，運用PCR技術可以實現目的基因的定點誘變。如圖

為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段

配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應體系中引物1和引物2的5,端分別設計增

加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關敘述不正確的是（）

酶aT

弓I物］三______________

二7引物2

酶第1可PCR酶\

引物］_L^-----------------------

一3----------------------1■引物2

酶a普輪KR酶b

弓I物1」一二二〒二二2221^|物2

'!酶b

A.引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入

B.復性溫度過高會導致引物不能與模板牢固結合，PCR擴增效率下降

C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.第3輪PCR結束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2

8.（2024?南通高三調研）如圖是被農桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環,

并以此環為模板進行PCR,擴增出T—DNA插入位置兩側的未知序列，據此來確定T—DNA

插入的具體位置。下列有關說法錯誤的是（）

未知序列引物①T-,DNA引物②未知序列

m弓一匚二乙二一?一玄多

限制st切點引物③引物④限制趟目點

A.農桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，T-DNA存在于其Ti質粒上

B.利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側的未知序列

C.若擴增循環〃次，需要2#i—2個引物

D.將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定T—DNA的插入位置

9.實時熒光定量RT—PCR技術需要在常規PCR基礎上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料

能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發出熒光信號。在流感流行季節，對懷疑流感病毒感染的

患者，可以通過實時熒光定量RT—PCR技術進行核酸檢測。下列相關敘述不正確的是（）

針

i.熱變性獸譬熒光物質點飛淬滅物質

III1IIIIIIIIIIIIII1I

2.復性/探針與模板的雜交

聚食覽⑹探針雜交?

IIIIIQfIIIIIII

IIII[IIIIIIII1IIIIII

3.延伸反應IIIIIIIIIII口f—9

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII

A.圖中的探針可能是利用熒光分子標記的流感病毒獨特的基因序列

B.核酸檢測是通過檢測熒光信號來確定樣本中是否有病毒核酸的

C.PCR技術利用了DNA雙鏈復制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化

D.用熒光RT-PCR技術測定病毒的核酸具有特異性

二、非選擇題

10.(2023?江蘇，22節選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術

構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：

擬構建的720bp|390bp|

注：EGFP熒光蛋白

基因結構EGFPAnBl

AnBl納米抗體。

喳土F2片段PCR引物

叱fFl片段NEE江門W1-及目的產

T7W3F2-R物片段

F1-R

D-一線性質粒

基因重組A廿"y~

載體

克隆流程PCR產物片段與重組酶

線性載體混合0

注：一表示PCR引物；

相同背景方框表示

同源序列。

圖1

(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時,配制的兩個反應體系中不同的有,

擴增程序中最主要的不同是o

(2)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環化質粒，直接用于轉

化細菌。這一過程與傳統重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有o

(3)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，下列敘述錯誤的有=

A.稀釋涂布平板需控制每個平板30~300個菌落

B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養基溫度太高

C.抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化

(4)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板、用引物Fl—F和

F2-R進行了PCR擴增，質粒Pl?P4的擴增產物電泳結果如圖2。根據圖中結果判斷，可

以舍棄的質粒有。

圖2

⑸對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是

11.基因工程在農業方面的應用發展迅速，我國轉基因作物的種植面積在世界有較高排名。

請回答下列相關問題：

(1)目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機會和可能，目的基因往往從相關的

_________________________的基因中進行篩選O

(2)目的基因可以人工合成、從基因文庫中獲取，還可以利用PCR技術獲取和擴增。如圖1

展示了PCR技術獲取和擴增目的基因的原理，請分析回答下列問題：

目的基因

圖1

①PCR技術利用了DNA半保留復制原理和原理。PCR的一次循環包括變性、

復性和延伸三個過程，復性的作用是______________________________________________

②將一個DNA分子進行擴增，理論上目的基因最早在第.次循環后獲得；第5次循環

后，可擴增得到.個目的基因。

(3)反向PCR可用于擴增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內側是已知序歹U，

外側為未知序列。請回答相關問題:

圖3經EcoR酶切后的DNA分子圖4環化后的DNA分子

①EcoRI酶切后得到的一AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是

EcoRI切割得到黏性末端的原因是___________________________________________

②不直接在圖2中DNA分子的兩端設計引物并進行擴增，原因是o

③圖4中環狀DNA進行PCR的過程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是（填“順時

針”或“逆時針”），PCR產物（填“含有”或“不含"）瓦oRI的酶切位點。

12.（2024?湖北華中師大附中高三模擬）幽門螺桿菌是一種常見的人類致病菌，其骨架蛋白

MreB通過影響胭酶活性而參與調控其致病性。為了更準確地分離出MreB蛋白，用重疊延伸

PCR技術（指在PCR技術的基礎上，采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈，通

過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項技術），將幽門螺桿菌M陽8基因中

編碼終止密碼子前的DNA序列與TAP標簽（可以標記幽門螺桿菌基因組中任何一個基因，且

不會影響基因的表達）進行連接，構建了融合表達蛋白MreB和TAP標簽的質粒，實驗流程如

圖所示。據圖回答下列問題：

切物2引物4

MreB基因TAP標簽

用引物1、引物2引物3,

引物1用引物3、引物4

進行PCR1一進行PCR2

---------<-------ot鏈

引物1引物2引物3引物4

B鏈

產物3-4

、變性后重疊延伸

a鏈

B鏈

PCR3EcoRI

基因TAP標簽

帶有標簽的基因

r'T)TScllTlI

EcoR1xhoI

Km%卡那霉素抗性基因

啟動子pK18mob限制酶識別序列及切割位點：

SacB

EcoRIXhoISamIEcoRI

質粒dTCGAGGGG^CCCG^AATTC

復制原點

（1）重疊PCR獲得帶有標簽的MreB基因

①獲得兩種具有重疊片段DNA的過程中，PCR1和PCR2必須在不同的反應體系中，原因是

②PCR3反應體系中所加入的引物是o

（2）重組質粒的構建

①為將帶有標簽的MreB基因定向插入到PK18mobSacB質粒中，需要在引物末端添加限制酶

識別序列，據圖分析，在引物1添加的序列所對應的限制酶是,在引物4

添加的序列所對應的限制酶是0經過這兩種酶酶切的帶有標簽的MreB基因

u

和PK18mobSacB質粒進行連接時，可選用（填E.coliDNA連接

酶”或“T4DNA連接酶”）。

②重組質粒中，K”產基因的作用是

專題突破10綜合PCR的基因工程問題

1.D

2.C［不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是

與乙鏈結合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。］

3.D［兩種突變引物能互補配對，因此過程①必須分兩個反應系統進行，A錯誤；過程①

至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產物，B錯誤；過程②獲得的產物不都可以完成

延伸過程，因為子鏈只能從引物的3'端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，

由于模板中不含有通用引物，則產生16個突變基因共需要消耗16X2—2=30（個）通用引物，

而需要通用引物RP2的數量為30+2=15（個），D正確。］

4.C［過程③即PCR擴增，PCR技術中DNA解旋是在高溫下實現的，不需要加入解旋酶，

C錯誤。］

5.C［在PCRi中，需要兩種引物，將來在切取/K跖基因時，在基因的左側需要用限制酶

H加dill來切割，在基因的右側用限制酶SacI切割，因此在PCRi中結合到基因右端的引物

選擇引物C,從題圖中看，另一個引物應含有突變堿基C,所以選擇引物A,A正確；在PCR2

中，有一個引物結合到了基因的左端，應含有限制酶III識別的序列，所以要用到引物8,

而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應該結合到基因的右端，且從5'端到3'端的

序列中開始部位應含有SacI識別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCR,

過程主要是為了獲得大引物，則擴增2輪即可獲得目標產物，C錯誤；由于大引物較長，含

C與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR?復性過程中應適當提高溫度，便于

引物與模板鏈的結合，D正確。］

6.D［Ct值越小，說明所需循環的次數越少，被檢測樣本中病毒數目越多，D錯誤。］

7.D

8.B［農桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染

能力，A正確；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3,端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④

組合可擴增出兩側的未知序列，B錯誤；擴增循環〃次，得到2〃個DNA分子，總單鏈數為

2X2"即2"+i條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2.|一2個引物，C正確；不

同的DNA分子或DNA區段具有特異性，將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定

T—DNA的插入位置，D正確。］

9.C