ＤＮＡ粗提取和鑒定實驗設計與改進本實驗為高中生物學選擇性必修３《生物技術與工程》中基因工程的實驗內容。該實驗可以讓學生更加直觀地通過觀察掌握ＤＮＡ的理化性質，也是基因工程中獲取目的基因必不可少的實驗步驟。然而，該實驗本身屬于粗提取，最終得到的ＤＮＡ雜質含量較多，會影響ＤＮＡ沉淀的溶解和后續的二苯胺顯色反應，也無法繼續用做基因工程的實驗材料。對ＤＮＡ粗提物進行純化，并利用超微量紫外可見分光光度計進行ＤＮＡ純度的檢測，獲得了較純的基因組ＤＮＡ，進一步提升了該實驗的教學價值，有利于學生通過實驗充分掌握ＤＮＡ的性質及其提取的原理，得到的基因組ＤＮＡ也可以用于基因工程的其他實驗，如作為ＰＣＲ的模板進行擴增，使得不同實驗之間具有連續性，也讓學生更深入地理解基因工程的實驗設計及原理。實驗原理基因組ＤＮＡ位于細胞核內，獲取基因組ＤＮＡ首先要將細胞破碎從而釋放基因組ＤＮＡ。破碎細胞常用的方法是通過加入含有ＳＤＳ或ＣＴＡＢ等化學試劑的研磨液進行研磨或勻漿。另外，液氮冷凍研磨或蛋白酶處理與加入化學試劑研磨液的聯合使用更有利于細胞破碎基因組ＤＮＡ易溶于２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，不溶于酒精。因此可以利用酒精將ＤＮＡ以沉淀的方式析出再用２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀從而獲得基因組ＤＮＡ溶液。ＤＮＡ在加熱條件下與二苯胺試劑反應可生成藍色物質，可以通過顏色反應來確認是否成功提取出基因組ＤＮＡ。氯仿／異戊醇可以使蛋白質變性，有助于去除蛋白質，從而純化ＤＮＡ粗提液。ＤＮＡ在波長為２６０ｎｍ處有最大吸收值，蛋白質在２８０ｎｍ處有最大吸收峰，鹽和有機小分子在２３０ｎｍ處有最大吸收峰。純的ＤＮＡ其１．７＜ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．９，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＞２．０。若ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．７表示存在蛋白質污染，＞１．９則表示存在ＲＮＡ污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＜２．０說明存在鹽等小分子污染。實驗試劑與方法實驗試劑：研磨液，９５％乙醇，氯仿∶異戊醇（２４∶１），３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，１．５％二苯胺試劑。實驗方法：以新鮮菜花作為實驗材料。１．ＤＮＡ粗提取：稱取４ｇ菜花組織置于研缽中，加入７ｍＬ研磨液進行勻漿，勻漿至沒有大的組織塊，緩慢地將勻漿液轉移到１０ｍＬ離心管中，于１２０００ｒｐｍ離心１ｍｉｎ。轉移上述上清液至新的離心管中，加入２倍體積９５％乙醇，上下顛倒數次，可見白色ＤＮＡ絮狀沉淀。用玻璃棒同方向攪拌將ＤＮＡ絮狀物挑出，置于濾紙上吸干多余液體，再轉移至新的離心管中，加入２ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，上下顛倒或緩慢吸打，直至ＤＮＡ絮狀物完全溶解，得到ＤＮＡ粗提液。２．ＤＮＡ的鑒定：吸取１．５ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液作為實驗對照，吸取１．５ｍＬ上述ＤＮＡ粗提液作為實驗組。分別在對照組和實驗組中加入３ｍＬ二苯胺試劑，混合均勻后，于沸水浴加熱５ｍｉｎ，觀察并比較兩者顏色的變化。３．ＤＮＡ的純化：從剩余的ＤＮＡ粗提液中吸出２０μＬ備用，作為未純化的基因組ＤＮＡ對照。向剩余的ＤＮＡ粗提液中加入５００μＬ氯仿∶異戊醇（２４∶１），上下顛倒混勻２ｍｉｎ，１２０００ｒｐｍ離心１０ｍｉｎ。將上清液轉移至新的離心管中，加入１／１０體積的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，輕柔顛倒混勻，再加入２倍體積的９５％乙醇，輕柔顛倒混勻后，１２０００ｒｐｍ離心５ｍｉｎ，管底的沉淀即基因組ＤＮＡ。緩緩倒掉上清液，室溫待沉淀晾干后，加入１００μＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀，最終獲得純化的基因組ＤＮＡ。分別取２μＬ未純化和純化后的基因組ＤＮＡ溶液，利用超微量紫外可見分光光度計測定ＤＮＡ的純度。結果與分析１．ＤＮＡ粗提液的二苯胺鑒定：在獲得的１．５ｍＬ菜花組織ＤＮＡ粗提液中加入３ｍＬ１．５％的二苯胺試劑，沸水浴加熱５ｍｉｎ。結果顯示，與對照組（ＮａＣｌ溶液＋二苯胺試劑）相比，ＤＮＡ粗提液呈現明顯的藍色（圖１），說明本次實驗成功將基因組ＤＮＡ提取出來，且ＤＮＡ量較多，足以進行二苯胺顏色反應，可以肉眼觀察到明顯的顏色差異。２．不同破碎方法對ＤＮＡ粗提取的影響：為了獲得盡量多的組織研磨液，結合目前組織研磨常用的方法，分別采用破壁機電動勻漿、采用玻璃勻漿器和研缽手動勻漿。其中研缽研磨分為添加液氮研磨和不添加液氮研磨兩種方式，比較以上４種研磨方法對ＤＮＡ粗提取效果的影響。結果顯示，利用破壁機電動勻漿進行組織破碎，在破碎過程中會產生大量泡沫影響破碎過程，且破碎過程中會產生熱量，導致ＤＮＡ斷裂，呈現均勻的短片段，無法通過玻璃棒攪拌將ＤＮＡ絮狀物取出。這種現象同樣也出現在使用研缽研磨并且添加液氮的方法中。液氮研磨可以通過制造低溫保證ＤＮＡ不被胞內核酸酶降解，但是當加入液氮進行研磨后，在上清液中加入２倍體積的乙醇后ＤＮＡ不能形成絮狀物，而是呈現均勻分布的小片段，不利于后續用玻璃棒攪拌獲取ＤＮＡ的操作。與上述兩種方法相比較，使用玻璃勻漿器和研缽研磨得到的組織破碎液，加入乙醇后能夠肉眼看到大量白色ＤＮＡ絮狀物，可以用玻璃棒通過攪拌的方式將ＤＮＡ絮狀物取出。由于ＤＮＡ的二苯胺顏色反應中，需要有足夠多的ＤＮＡ，因此需要較多的植物組織。利用玻璃勻漿器研磨，因其空間較小，且玻璃易碎，研磨量大的組織費時費力，所以利用研缽更有利于大量植物組織的研磨。３．ＤＮＡ粗提液經純化后的純度變化：由于ＤＮＡ粗提液中仍然含有大量的雜質，如蛋白質等，純度太低，導致ＤＮＡ粗提取過程中出現ＤＮＡ沉淀不易溶解的問題，且純度低的基因組ＤＮＡ無法用于基因工程中的相關酶促反應，如ＰＣＲ等。利用氯仿／異戊醇將獲得的ＤＮＡ粗提液進行純化，利用超微量紫外可見分光光度計對未純化和純化的基因組ＤＮＡ進行純度檢測。結果發現，未純化的基因組ＤＮＡ其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．２３，比值遠小于１．８，說明該ＤＮＡ粗提液中含有蛋白質污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝１．１９，比值遠小于２．０，說明該ＤＮＡ粗提液中可能含有小分子有機物的污染（表１）。而純化后的基因組ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８７，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝２．０６，說明ＤＮＡ純度較高，基本不含蛋白質和小分子的污染（表１）。在ＤＮＡ粗提取實驗中，最關鍵的一步就是破碎細胞使得基因組ＤＮＡ得到釋放。另外，本實驗采用二苯胺試劑進行ＤＮＡ的鑒定，ＤＮＡ在４０—４００μｇ范圍內，與二苯胺試劑反應生成的藍色物質吸光度與ＤＮＡ濃度呈線性關系。如果ＤＮＡ含量太低則二苯胺顯色反應無法得到預期的結果。想要達到肉眼明顯可見的藍色，提取的ＤＮＡ含量需達到每毫升百微克，這就在破碎細胞提取ＤＮＡ時需要較多的植物組織。這樣就帶來一定的問題：①研磨費時費力，