生物技術實驗BiotechnologyExperiment一、課程性質和任務生物技術實驗是基礎醫學實驗教學的重要組成部分，內容涵蓋分子生物學、生物化學、醫學遺傳學、細胞生物學、醫學免疫學等學科領域中常用的基本操作技術。現代醫學的高速發展，要求學生不僅要有較高的理論水平，還要有較強的科研能力。通過生物技術實驗教學，使學生掌握了蛋白質分離純化與含量測定、核酸提取分離純化與含量測定、分子雜交、基因擴增、細胞培養與傳代等技術原理和基本操作。培養學生科研工作的基本能力、從事科學研究的意識和嚴謹的科學態度，提高學生實驗動手能力和解決問題的能力。同時以科研促進教學，將科研方面取得的、成熟的新實驗技術引入學生實驗教學中，進一步增強學生的實驗技能，提高學生實踐能力、思維能力和創新能力。二、基本內容和要求1、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質基本內容：聚丙烯酰胺凝膠電泳,是在區帶電泳原理的基礎上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用電泳基質的不連續體系（即凝膠層的不連續體系、緩沖液離子成分的不連續性、pH的不連續性及電位梯度的不連續性），使樣品在不連續的兩相間積聚濃縮成薄的起始區帶（厚度1—2mm），然后再進行電泳分離。基本要求：掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理，熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術。2、葡聚糖凝膠層析分離蛋白質基本內容：凝膠層析法是利用凝膠把分子大小不同的物質分離開的一種方法，又稱分子篩層析法，排阻層析法。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同進行分離。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內部（阻滯作用小）而沿凝膠顆粒間隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠內部（阻滯作用大），流程長，流速緩慢，最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質得到分離。基本要求：掌握葡聚糖凝膠層析分離蛋白質的方法，了解核酸—蛋白檢測儀及部分收集器的工作原理和使用。3、動物組織細胞內DNA的分離和含量測定基本內容：用適當方法將細胞破碎，使DNA處于易被抽提的狀態，從脂類、蛋白質等物質中將DNA分離出來并去除RNA。DNA堿基中含有的共軛雙鍵對紫外光有強烈的吸收，用波長260nm紫外光與標準DNA比色測定，即可求出樣品中DNA的含量。基本要求：熟悉從新鮮動物組織中分離DNA的方法，掌握用紫外分光光度法測定DNA含量。4、酵母蔗糖酶米氏常數（Km）的測定基本內容：蔗糖酶在pH5.0緩沖液中與不同濃度的蔗糖混合，恒溫培養，經過規定時間生成一定數量的還原糖。還原糖在堿性溶液中與硫酸銅共熱使二價銅（Cu2+）還原生成氧化亞銅，氧化亞銅再使磷鉬酸還原成鉬藍，用分光光度法測定鉬藍，并進而判定還原糖的生成量，以此代表反應開始階段的初速度（V）然后以不同底物濃度的倒數按林—貝氏作圖法，從橫軸上截距求出Km值。基本要求：了解底物濃度對反應速度的影響及Km值的意義，掌握蔗糖酶Km的測定方法。5、Vc的性質、含量測定基本內容：還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯酚靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質干擾時，一定量的樣品提取液還原標準2，6-二氯酚靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。基本要求：了解維生素C的主要性質，學會測定蔬菜和水果中維生素C含量的方法。6、Lowry氏法測定蛋白質含量基本內容：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物，Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物），在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。在500nm處測定樣品吸光值，確定其蛋白質含量。基本要求：學習Lowry氏法測定蛋白質的原理和方法，掌握分光光度法。基本要求：了解溫度、pH、激活劑、抑制劑對酶活性的影響，學習酶活性的判定。7、人類非顯帶染色體核型分析基本內容：利用顯微照相裝置拍攝人類非顯帶染色體的圖像，并且將其放大成染色體照片;然后根據國際上統一的標準，按染色體的長短、著絲粒的位置、隨體的有無等指標，將人類的46條染色體分成7個組并編上號,最后再將染色體剪貼到專門的實驗報告單上，從而制成染色體核型(karyotype)圖，并檢查正常與否。這個過程就稱為核型分析。利用核型分析可以檢查人體的染色體數目是否正常，并可發現較大的染色體畸變以及判定性別等。基本要求：熟悉正常人類染色體的數目及形態特征，掌握非顯帶染色體的核型分析方法。8、X染色質制備與觀察基本內容：正常女性的間期細胞核中緊貼核膜內緣有一個染色較深的橢圓形小體，即X染色質。通過采取口腔黏膜細胞作為檢查材料，經染色后可進行觀察。基本要求：熟悉X染色質標本的制作方法，掌握細胞核染色方法。9、小鼠骨髓染色體制作及觀察基本內容：小鼠骨髓細胞中的造血干細胞是生成各種血細胞和原始細胞，具有高度的分裂能力，本實驗采用這一材料，通過前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進行染色體組型分析。基本要求：掌握動物骨髓染色體標本制備基本過程、原理。10、PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳基本內容：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，在體外模擬DNA的復制過程，經過變性、復性、延伸三個過程，在一對附加的引物之間誘發聚合反應，短時間內可將要研究的目的DNA擴增數百萬倍。基本要求：了解PCR技術的原理，掌握PCR技術的程序和步驟。11、擴散反應基本內容：用一定濃度的瓊脂制成凝膠后，其內部形成一種多孔的網狀結構，可允許大分子物質通過。可溶性抗原與抗體在瓊脂糖凝膠自由擴散后形成沉淀。基本要求：掌握抗原抗體定性沉淀反應原理，了解IgG等免疫球蛋白的定量檢測技術。12、對流免疫電泳基本內容：對流免疫電泳是雙向瓊脂擴散和電泳技術相結合的實驗技術。抗原在堿性緩沖液中帶負電，向正極移動；抗體蛋白質較大，負電荷少，借電滲作用緩慢移向負極，在適當的條件下，可形成抗原抗體反應而出現沉淀。基本要求：掌握抗原抗體在電場中的反應條件；熟悉對流免疫基本技術。13、血型測定和免疫妊娠膠體金間接凝集基本內容：用膠體金標記技術，檢測尿中有無HCG。首先將鼠抗人HCG的單克隆抗體（一抗）吸附在膠體金顆粒上（膠體金呈紫紅色散在顆粒狀，肉眼可見）并松弛地附著在A處。鼠抗人HCG（一抗）及兔抗鼠Ig（二抗）分別吸附在檢測線B處及陽性對照線（C處）的硝酸纖維膜上。當尿液通過毛細作用上行時，尿中的HCG與A處的抗HCG膠體金結合，并且HCG—抗HCG—膠體金繼續上行至檢測線B處，并與B處的抗HCG發生反應，形成雙抗體夾心免疫復合物，抗體Fc段標有膠體金，即成清晰的紫紅色。基本要求：通過檢測尿中有無HCG，掌握膠體金技術的原理。14、免疫熒光實驗基本內容：根據抗原抗體反應原理，將已知的抗體或抗原分子標記上熒光素，與相應的抗原或抗體起反應，從而使形成的抗原抗體復合物攜帶上一定量的熒光素，利用熒光顯微鏡可看出發出熒光的抗原抗體的結合物。基本要求：了解免疫熒光實驗的基本原理，掌握熒光免疫基本實驗技術。15、淋巴細胞轉換實驗基本內容：正常機體的T淋巴細胞在體外培養過程中受到有絲分裂原刺激，可轉化為淋巴母細胞。目前最常用植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）作為分裂原來檢測受試者的淋巴細胞轉化率，從而判定其細胞免疫功能。細胞免疫缺陷時，患惡性腫瘤或某些其他疾病時，轉化率顯然降低。稱為淋巴細胞轉化實驗。基本要求：了解有絲分裂原刺激淋巴細胞轉化活性，掌握淋巴細胞分離與培養技術，熟悉淋巴細胞的轉化率計算。16、ELISA法檢測白細胞介素2基本內容：IL-2主要是由活化的T細胞產生，在機體的免疫應答中發揮主要作用。它有較強的自分泌性和旁分泌性，能促進T細胞NK細胞增殖及活化、誘導LAK和TIL細胞的產生，參與B細胞增殖及活化等作用。IL-2產生水平反映了T細胞的功能。本試驗是采用兩株識別不同表位的抗IL-2mAb，其中一株作為包被抗體，以識別和結合待檢標本中的IL-2，另一株作為酶標抗體，與結合于包被抗體上的IL-2的另一表位結合，并催化底物呈色。基本要求：掌握用酶聯免疫吸附的方法檢驗可溶性抗原分子的技術，了解細胞因子的檢測手段。17、小鼠巨噬細胞吞噬實驗基本內容：吞噬細胞分小吞噬細胞、大吞噬細胞。前者為外周血中的中性粒細胞，后者包括外周血的單核細胞和組織中的巨噬細胞。檢測其功能，有助于疾病的診斷和判斷機體非特異性免疫水平。基本要求：掌握大吞噬細胞吞噬功能檢測方法，熟悉機體非特異免疫功能。三、學時分配：序號內容實驗學時1聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質82葡聚糖凝膠層析分離蛋白質83動物組織細胞內DNA的分離和含量測定44酵母蔗糖酶米氏常數（Km）的測定45Vc的性質、含量測定46Lowry氏法測蛋白質含量47人類非顯帶染色體核型分析48X染色質制備與觀察49小鼠骨髓染色體制作及觀察410PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測411單雙擴散212對流免疫電泳213血型測定和免