桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統概述及案例分享Baculovirus–insect

cell

expression

system,BEVS-IC北京義翹神州科技股份有限公司BEVS-IC的組成與優化1BEVS-IC的應用2案例展示3CONTENT義翹神州BEVS-IC的組成與優化01義翹神州義翹神州桿狀病毒：一類具有囊膜包裹的雙鏈環狀DNA病毒，以節肢動物為專一性宿主。表達用桿狀病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)doi:10.1002/cpps.47義翹神州桿狀病毒：一類具有囊膜包裹的雙鏈環狀DNA病毒，以節肢動物為專一性宿主。表達用桿狀病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)LifeCycleExpressionStartPromotersHoursPostInfectionInfectionDNAReplicationVirionProductionCellLysisImmediateEarly(0-6hpi)ie0ie1ie2DelayedEarly(3-6hpi)39kLate(3-24hpi)p6.9(basic)vp39VeryLate(18-24to72hpi)polyhedrinp10桿狀病毒發展重要節點：19831ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCells1993BAC-to-BACExpressionSystem1953Firstcomprehensivereviewofbaculoviruschemistryandbiochemistry1962Establishedcellstrainsfromtissueculturedinvitro1971Discoveryandidentificationofthebaculovirus,Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus1972ThestructureofNuclearPolyhedrosisVirusesI.Theinclusionbody1973AcMNPVwasisolated1978~1992Analysisofbaculovirusgenomesandusedtodeveloptherecombinantbaculovirusvectors2008~2019flashBac2011~2016GeneticengineeringofbaculovirusThestorycontinues…2007~2017Insectcellengineering義翹神州昆蟲細胞發展重要節點：1983Establishmentofsf9（）(Spodopterafrugiperda)1994EstablishmentofTn-5B1-4

(HighFive)(Trichopulsiani)1915spermatidfromSamiaceropia1915~1958

Exploreinsectcellcultureinvitro1959Establishmentofovariancellline(Bombyxmori)1962Establishmentofovariancellline(Antheraeaeucalypti)1970Establishmentofsf21(Spodopterafrugiperda)1986EstablishmentofTn-5B1(Trichopulsiani)2010EstablishmentofAo38Thestorycontinues…義翹神州BEVS-IC優化義翹神州BEVS-IC的應用02義翹神州昆蟲-桿狀病毒與其他表達系統的比較：經濟周期短高產量大腸桿菌表達系統后修飾匱乏易成包涵體難表達大分子蛋白酵母表達系統經濟快速BEVS-IC后修飾高產量高細胞密度可溶表達周期長大分子蛋白成本高哺乳動物細胞表達系統修飾完全可溶表達周期長成本高義翹神州特殊糖基化類型

轉化難度高應用場景重組蛋白的應用生物藥結構生物學研究天然vs重組蛋白天然蛋白重組蛋白豐度豐度低無豐度限制動物源有無產率低高批間差不可控可控andsomuchmore…工業酶生物材料藥物開發VLP/亞單位疫苗開發診斷試劑義翹神州表達流程義翹神州??SIMSF無血清培養基——專為Sf9和Sf21細胞設計貨號：MSF1特點：無血清、無蛋白最大細胞生長密度：1.2×107cells/mLSf21細胞設計貨號：MSF1特點：無血清、無蛋白最大細胞生長密度：1.2×107cells/mL：蛋白表達、Sf9/Sf21細胞培養、重組桿狀病毒的包裝和擴增昆蟲細胞培養基義翹神州?SIMSF無血清培養基——專為Sf9和Sf21細胞設計貨號：MSF1

特點：無血清、無蛋白

最大細胞生長密度：1.2×107

cells/mL

用途：蛋白表達、Sf9/Sf21細胞培養、重組桿狀病毒的包裝和擴增?SIMHF無血清培養基——專為Hi-5細胞開發貨號：MHF1特點：無血清、無蛋白最大細胞生長密度：7.5×106cells/mL用途：Hi-5細胞的培養、重組蛋白表達?無動物源、無血清SIMSF培養基貨號：MSF-AF特點：無血清、無蛋白、無動物源用途：蛋白表達、Sf9/Sf21細胞培養、重組桿狀病毒的包裝和擴增?無動物源、無血清SIMHF培養基貨號：MHF-AF特點：無血清、無蛋白、無動物源用途：Hi-5細胞的培養、重組蛋白表達相同培養條件下，Sf9細胞在義翹神州和競爭品牌昆蟲細胞培養基中的生長水平相同培養條件下，Hi-5細胞在義翹神州和競爭品牌昆蟲細胞培養基中的生長水平SIMHFCompetitorACompetitorB酶轉錄因子超大蛋白跨膜蛋白病毒結構蛋白適用BEVS的蛋白類型分泌蛋白復合體義翹神州案例展示03義翹神州重組表達策略制定ProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructconstruct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最終應用決定表達和純化策略義翹神州構建設計方案截去影響蛋白表達的區段Construct1Construct2

單次跨膜蛋白胞外區(MW=~90KDa)

昆蟲細胞表達

純化分泌蛋白

刪去N端高疏水區促進蛋白分泌表達義翹神州構建設計方案功能區域串聯表達Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重組人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域復合酶昆蟲細胞表達純化胞內蛋白

通過功能區串聯獲得高產重組蛋白義翹神州AlphaFoldmotif的靈活運用Construct1：串聯形式1Construct2：串聯形式2功能性motif的構建形式對蛋白的聚集情況有明顯影響義翹神州Buffer:PBSDetergentformula1Buffer:PBSDetergentformula2Buffer:PBSDetergent:DDMNi-affinitypurificationNi-affinitypurificationSECpurification不同Buffer蛋白對純化的影響義翹神州整體策略優化

重組表達轉錄因子蛋白

蛋白高度無序，穩定性差

昆蟲細胞表達純化胞內蛋白

構建、培養和純化過程綜合優化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合標簽觀察到目標蛋白表達

目標蛋白未GSH梯度洗脫

目標蛋白降解嚴重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培養體積=10XV1

蛋白降解

培養體積=V1

收集Elute2并置換Buffer

目標蛋白在高鹽buffer中較為穩定Buffer[NaCl]=150mMBuffer[NaCl]=500mM高無序度蛋白Longestdisorderregion=166AA(166AA/384AA)Percentageofcoilstructure=79%C端融合標簽觀察到目標蛋白表達

目標蛋白未GSH梯度洗脫

目標蛋白降解緩解義翹神州美國子公司賓夕法尼亞州費城區北京總部上海分公司歐洲子公司德國法蘭克福蘇州子公司泰州子公司廣州分公司日本子公司義翹神州義翹神州堅持自主研發生產打造中國生命科學研究“一站式”試劑與服務支撐平臺人才與設施榮譽資質設施：---25,000+平米研發中心

---7,000平米潔凈車間

團隊：900+---碩士以上學歷占1/3---10+歐美深造經歷14,000+

精品抗體6,500+

重組蛋白47,000+