第四章發酵工業無菌技術與污染防治第一節概述第二節發酵工業污染的防治策略第五節空氣除菌第三節發酵工業的無菌技術第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術第四章發酵工業無菌技術與污染防治第一節概述1.什么叫發酵工業無菌技術？發酵工業無菌技術是指在發酵工業實際生產實踐中，為了防止雜菌污染而經常采用的消毒與滅菌技術2.為什么說無菌技術對現代發酵工業非常重要？因為現代發酵工業絕大多數采用純種培養，因而要求在發酵的全過程只能有生產菌而不允許有“雜菌”存在，否則將導致嚴重的后果。新第四章-無菌技術第一節概述3.為了保證純種培養，在生產中要采取什么措施？在生產菌種接種之前，要對發酵培養基、空氣系統、流加料、發酵罐及管道系統等進行滅菌，同時還要對環境進行消毒，防止雜菌和噬菌體的大量繁殖。

滅菌與消毒有何不同？它們各適用于哪些情況的無菌處理？第四章發酵工業無菌技術與污染防治新第四章-無菌技術第一節概述4.幾個重要概念污染概率：1000批次的發酵滅菌中出現染菌的次數滅菌（sterilization）：用物理或化學方法殺死物料或設備中所有生命物質的過程消毒(disinfection)：用物理或化學方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物的過程除菌(degerming)：用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子的過程防腐(antisepsis)：用物理或化學方法殺死或抑制微生物生長和繁殖的過程新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略（1）培養基因雜菌而消耗損失，造成生產能力的下降。（2）雜菌產生新的代謝產物，或雜菌污染改變了培養液的某些理化性質，使發酵產物的提取變得困難，造成得率降低或產品質量下降。（3）雜菌代謝會改變原反應體系的pH值，使發酵發生異常。（4）雜菌分泌某些水解酶使產物分解，導致發酵失?。?）若發生噬菌體污染，會使細菌細胞裂解，導致發酵失敗一、污染對發酵會帶來什么危害？新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略染菌對發酵所造成的危害及后果與

有關A.發酵生產的產品B.雜菌的種類和性質C.染菌發生的時間D.染菌的途徑和程度？二、染菌對發酵產生什么影響？如何應對？新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略1.染菌對不同菌種發酵的影響在發酵過程中，不同菌種所用的培養基、發酵條件、發酵周期以及產物性質不同，染菌的類型和造成的危害程度也各不相同

細菌：發酵周期較短，以防止噬菌體污染為主

霉菌：發酵周期較長，產物類型多樣，染菌情況比較復雜

酵母菌：需特別防止生長較快的細菌和野生酵母菌的污染

疫苗產生菌：常用基因工程菌，一旦染菌，必須全部廢棄二、染菌對發酵產生什么影響？如何應對？新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略2.不同發酵時期染菌對發酵的影響

種子擴培時期染菌種子染菌對危害極大，必然導致發酵失敗，故應嚴格控制

應對措施：滅菌后棄去

發酵前期染菌染菌后，雜菌迅速繁殖，與生產菌爭奪營養，嚴重抑制生產菌的生長，導致發酵產物積累大大減少，甚至造成發酵失敗應對措施：迅速重新滅菌，再接種，從頭發酵二、染菌對發酵產生什么影響？如何應對？新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略二、染菌對發酵產生什么影響？如何應對？2.不同發酵時期染菌對發酵的影響

發酵中期染菌這時染菌對發酵生產危害極大，不僅影響生產菌的繼續生長，而且會嚴重干擾生產菌的產物合成代謝，使發酵產物積累減少（原因何在？）應對措施：應盡可能做到早發現、快處理。處理方法應根據各種發酵的特點和具體情況來決定。如抗生素發酵與檸檬酸發酵的處理措施不同新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略二、染菌對發酵產生什么影響？如何應對？2.不同發酵時期染菌對發酵的影響

發酵后期染菌這時染菌對發酵生產的影響相對較小應對措施：一般可繼續進行發酵，即使污染迅速加重，也可以采取提前放罐來減少染菌造成的損失3.染菌對發酵產物提取和產品質量的影響染菌對發酵后處理有極大影響，主要是增加了發酵產物的提取難度，影響發酵產品的質量（例子）新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治1.染菌的檢查與染菌類型的判斷在發酵過程中，采用準確、快速的方法及早發現雜菌并及時處理是避免造成嚴重損失的重要手段。檢查雜菌類型及其可能途徑的主要方法有：（1）顯微鏡檢查法（2）平板劃線培養檢查法（3）肉湯培養檢查法（4）發酵過程的異?，F象觀察法新第四章-無菌技術菌體濃度新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治2.污染的原因分析

種子帶菌空氣帶菌設備滲漏滅菌不徹底操作失誤技術管理不善（1）造成發酵染菌的普遍原因是什么？（表4-1、4-2）新第四章-無菌技術新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治2.污染的原因分析（2）污染原因分析方法從污染雜菌的種類進行分析

污染的雜菌

可能的原因耐熱芽孢桿菌培養基或設備滅菌不徹底不耐熱雜菌種子帶菌、空氣除菌不徹（球菌、無芽孢桿菌）底、設備滲漏或操作問題淺綠色菌落冷卻盤管滲漏霉菌無菌室滅菌不徹底或無菌操作問題酵母菌糖液滅菌不徹底，糖液放置時間過長新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治2.污染的原因分析

從污染時間進行分析

發酵前期污染：種子帶菌、培養基或設備滅菌不徹底、接種操作不當或無菌空氣帶菌

發酵后期污染：中間補料污染、設備滲漏或操作問題

從染菌的程度進行分析各個或多個發酵罐染同一種雜菌空氣系統存在問題個別罐連續染菌某個設備存在問題新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治3.雜菌污染的途徑及其預防（1）種子帶菌及其防治

培養基及器具徹底滅菌避免菌種在移接過程中受污染避免菌種在培養過程或保藏過程中受雜菌污染新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治3.雜菌污染的途徑及其預防（2）過濾空氣帶菌及其防治完善空氣凈化系統：空氣除菌凈化流程和設備的設計、過濾介質的選用和裝填、過濾介質的滅菌和管理生產上經常采用的措施有（P62、72）提高空壓機進口空氣的潔凈度設計合理的空氣預處理流程設計和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治3.雜菌污染的途徑及其預防（3）設備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治設備滲漏染菌主要是指發酵設備、管道、閥門等在長期使用過程中，由于化學腐蝕、電化學腐蝕、磨蝕、加工制作不良等原因形成微小漏孔后發生滲漏而染菌設備的“死角”是指由于操作、設備結構或人為因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能到達預定的滅菌部位或該部位的冷空氣不易在加熱過程中排凈，從而不能達到徹底滅菌要求的部位?！八澜恰蓖前l酵罐和設備的盲端新第四章-無菌技術新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治3.雜菌污染的途徑及其預防（3）設備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治設備滲漏造成染菌的防治：選用優質的制造材料，定期進行檢查“死角”的種類及其消除：

發酵罐的“死角”

①加強清洗并定期鏟除污垢；②安裝邊閥，消除管道盲端；③加強罐體清洗，減少罐底積垢

管道安裝不當或配置不合理形成的“死角”

①采用單獨的排氣、排水和排污管；②配置單獨的滅菌系統；③法蘭的加工、焊接和安裝要符合滅菌要求新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治3.雜菌污染的途徑及其預防（4）培養基滅菌不徹底導致染菌及其防治

原料性狀的影響滅菌時溫度與壓力不對應造成染菌滅菌過程中產生的泡沫造成染菌連續滅菌維持時間不夠或壓力波動大而造成染菌滅菌后期罐壓聚變造成染菌新第四章-無菌技術第二節發酵工業污染的防治策略三、雜菌污染的防治3.雜菌污染的途徑及其預防（5）操作不當引起染菌

在放大移種時或發酵過程中，罐內壓力跌到零，使外界空氣進入而染菌；泡沫頂蓋造成染菌；管道閥門操作不當造成發酵液倒流（6）噬菌體污染及其防治環境污染是噬菌體染菌的主要根源。最有效的防治方法是以凈化環境為中心的綜合防治法（具體內容見P64）新第四章-無菌技術第三節發酵工業的無菌技術發酵工業常用的無菌技術和方法有：1.干熱滅菌法滅菌條件：160~170℃下保溫1~2h。適用范圍：空的玻璃器皿、金屬用具和其他耐高溫的物品禁用：帶有膠皮、塑料的物品、培養基優點：滅菌器皿保持干燥新第四章-無菌技術發酵工業常用的無菌技術和方法有：2.濕熱滅菌法滅菌條件：121℃15~20min，115℃30min適用范圍：培養基、玻璃器皿、無菌水、緩沖液、金屬用具優點：滅菌效果好，適用范圍廣——利用飽和蒸汽進行滅菌的方法第三節發酵工業的無菌技術新第四章-無菌技術發酵工業常用的無菌技術和方法有：3.射線滅菌法最常用的是紫外線，但只能用于物體表面、超凈工作臺、無菌室和培養室等環境滅菌——利用紫外線、高能電磁波或放射性物質產生的高能粒子進行滅菌的方法第三節發酵工業的無菌技術新第四章-無菌技術發酵工業常用的無菌技術和方法有：常用的化學藥劑是甲醛、漂白粉（次氯酸鈉）、高錳酸鉀、環氧乙烷、季銨鹽（如新潔爾滅）等。適用范圍：發酵工廠環境的消毒禁用：培養基4.化學藥劑滅菌法——使用某些化學試劑與微生物發生反應而將之殺滅的方法第三節發酵工業的無菌技術新第四章-無菌技術發酵工業常用的無菌技術和方法有：5.過濾除菌法——利用過濾方法阻留微生物以達到除菌的目的適用范圍：不耐高溫的液體培養基組分和空氣的過濾除菌（大量制備無菌空氣）6.火焰滅菌法——利用火焰直接殺死微生物的滅菌方法適用范圍：金屬小用具（接種針、接種環、接種鏟、小刀、鑷子）以及玻璃試管和三角瓶口等器具的滅菌優點：方法簡單、滅菌徹底局限性：適用范圍有限第三節發酵工業的無菌技術新第四章-無菌技術第四節發酵培養基及設備管道滅菌

發酵工業中，培養基滅菌工作的要求及關鍵是什么？滅菌的要求是：既要達到滅菌的目的，又要使培養基組成成分的破壞減少至最低滅菌工作的關鍵是：恰當掌握加熱溫度和受熱時間

一般衡量滅菌徹底與否的標準是什么？是以能否殺滅芽孢細菌為標準新第四章-無菌技術一、濕熱滅菌原理加熱滅菌的原理是當溫度超過微生物生長溫度的上限時，微生物細胞中的蛋白質等大分子物質會發生不可逆變性，而使微生物在很短的時間內死亡。濕熱滅菌的原理是利用飽和蒸汽所具有的強穿透力以及蒸汽在冷凝時所釋放出的大量熱能，使微生物細胞中的蛋白質、酶和核酸分子內部的化學鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，造成微生物死亡。第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術幾個重要概念

致死溫度：殺死微生物的極限溫度

致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間

熱死時間：在規定溫度下殺死一定比例微生物所需要的時間

熱阻：微生物對熱的抵抗力，即微生物在某一特定條件下（主要是溫度）的致死時間

相對熱阻：某一微生物在某一條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間之比一、濕熱滅菌原理第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術1.滅菌時間計算滅菌時間的基本公式t=2.303/（klg—）N0Nt

滅菌時間取決于污染程度（N0）、滅菌程度（殘留菌數Nt）和k值。比死亡速率常數k是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據工程上在進行滅菌設計時，一般采用Nt=0.001，即在1000次滅菌中允許有一次染菌的機會（染菌概率）第四節發酵培養基及設備管道滅菌二、影響滅菌效果的因素新第四章-無菌技術對數殘留定律——對微生物進行濕熱滅菌時，培養基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的微生物數量成正比。新第四章-無菌技術對數殘留定律N——培養基中的微生物個數τ——時間（S）K——比死亡速率（S-1）dN/dτ——死亡速率新第四章-無菌技術對數殘留定律積分并整理：新第四章-無菌技術對數殘留定律反應速度常數是判斷微生物耐熱的基本依據。在相同的溫度下，不同微生物的k值不同。K值愈小，則此微生物愈耐熱。有時習慣上也采用“1/10衰減時間D”表示。即活菌在受熱過程中減少到原來數目1/10所需的時間。即：新第四章-無菌技術對數殘留定律（1）滅菌時間取決于污染程度N0

、滅菌程度Nτ、和K值；（2）Nτ=0，τ為無窮大，無意義，事實上也不可能。新第四章-無菌技術對數殘留定律（3）一般采用Nτ=0.001，即1000次滅菌中有1次失敗。新第四章-無菌技術2.滅菌溫度隨著溫度的變化，比死亡速率K的值變化很大。溫度對K值的影響，遵循阿累尼烏斯方程：新第四章-無菌技術二、影響滅菌效果的因素

2.滅菌溫度滅菌溫度與滅菌速率常數的關系（阿累尼烏斯方程（式4-8）

K——

菌死亡的速度常數（s-1

）A——

阿累尼烏斯常數（s-1）R——

氣體常數（8.314J／mol.K）T——

絕對溫度（K）E——

微生物死亡活化能（J/mol）Exp——2.71新第四章-無菌技術2.滅菌溫度——相同溫度下，不同微生物K值不一樣，K值愈小，微生物愈耐熱；——同一微生物，在不同滅菌溫度下，K值不同，滅菌溫度愈低，K值小；溫度愈高，K值愈大。新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇1在培養基滅菌過程中，除了雜菌死亡外，還拌隨著培養基成分的破壞，因此必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養基的破壞降低至最低的工藝條件。2培養基的破壞屬于分解反應C——對熱不穩定物質的濃度（mol/L）K’——分解速率常數（S-1）τ——分解反應時間（S）新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇3分解速率常數K’和溫度的關系，也可用阿侖尼烏斯方程式表示新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇A’——阿侖尼烏斯常數R——氣體常數[8.314J/(mol.K)]T——熱力學溫度（K）ΔE’——殺死細菌芽孢的活化能（J/mol）Exp——2.71新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇4溫度從T1上升至T2時，K和K’的變化情況（1）溫度T1時（2）溫度T2時新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇（3）兩式相除（4）同樣，在培養基成分破壞上也可得一類似關系式：（5）兩式相除新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇殺滅某些細菌芽孢和B族維生素分解的ΔE名稱 ΔE（J/mol)葉酸 70.3泛酸 87.9維生素B12 96.7維生素B1鹽酸鹽 92.1嗜熱脂肪芽孢桿菌 283枯草桿菌 318肉毒梭菌 343腐敗厭氣菌 303新第四章-無菌技術滅菌溫度的選擇滅菌溫度和滅菌時間對維生素B1破壞的比較滅菌溫度oC 滅菌時間min 維生素B1破壞量%100 400 99.3110 36 67115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 2150 0.01 <1新第四章-無菌技術培養基滅菌一般選擇高溫快速滅菌法。其理論依據是：當滅菌溫度升高時，微生物死亡速率大于培養基成分破壞的速率。為了達到相同的滅菌效果，提高滅菌溫度可以明顯縮短滅菌時間，并可減少培養基因受熱時間長而遭到的損失（表4-5、4-6）2.滅菌溫度第四節發酵培養基及設備管道滅菌二、影響滅菌效果的因素新第四章-無菌技術3.培養基成分油脂、糖類、一定濃度的蛋白質、低濃度（1%~2%）的NaCl溶液能會提高微生物的耐熱性，所以滅菌溫度要高些。4.培養基pHpH6.0~8.0時微生物耐熱能力最強，pH小于6.0時，能促進微生物死亡。培養基pH越低，滅菌所需時間越短。（表4-7）pH對微生物的耐熱性影響很大第四節發酵培養基及設備管道滅菌二、影響滅菌效果的因素新第四章-無菌技術5.培養基的物理狀態培養基的物理狀態對滅菌具有極大的影響。固體培養基的滅菌時間要比液體培養基的滅菌時間長。原因何在？6.泡沫泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，對滅菌極為不利7.培養基中的微生物數量和種類培養基中的微生物數量越多，達到無菌要求所需的滅菌時間也越長；含芽孢桿菌多的培養基，要適當提高滅菌溫度并延長滅菌時間第四節發酵培養基及設備管道滅菌二、影響滅菌效果的因素新第四章-無菌技術分批滅菌（實罐滅菌）是將配制好的培養基放入發酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養基和所用設備一起進行滅菌的操作過程優點：不需要專門的滅菌設備，設備簡單投資少滅菌效果可靠對蒸汽壓力要求較低（3~4MPa）適用性：中小型發酵罐第四節發酵培養基及設備管道滅菌三、分批滅菌新第四章-無菌技術1.滅菌工藝過程

排放夾套或蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，夾套通入蒸汽；發酵罐溫度升到70℃時，開始由空氣過濾器、取樣管和放料管通入蒸汽，當發酵罐內溫度達到120℃，滅菌進入保溫階段；在保溫階段，向液面以下的各管道通入蒸汽，從液面以上的其余各管道排出蒸汽，不留死角，維持壓力和溫度到保溫結束；依次關閉各排氣、進氣閥門，并通過空氣過濾器迅速向罐內通入無菌空氣，維持發酵罐降壓過程中的正壓，并用冷卻水降溫第四節發酵培養基及設備管道滅菌三、分批滅菌新第四章-無菌技術2.滅菌時間的計算分批滅菌過程包括升溫、保溫和冷卻三個階段。滅菌主要是在保溫階段實現的，但在升溫的后期和冷卻的初期，也有一定的滅菌效果，所以分批滅菌時間的計算應包括這兩個階段。第四節發酵培養基及設備管道滅菌三、分批滅菌新第四章-無菌技術由于在升溫和冷卻階段溫度是不斷變化的，而比死亡速率k值也隨溫度不斷變化，計算滅菌效果十分復雜。一般先計算出升溫階段平均的菌死亡速率常數km和加熱時間tp，再計算升溫階段結束時培養基中殘留菌數Np，最后由式（4-19）計算保溫階段所需保溫時間t考慮到滅菌的可靠性主要取決于保溫階段，故可以簡單地利用式（4-3）來粗略估算滅菌所需要的時間2.滅菌時間的計算第四節發酵培養基及設備管道滅菌三、分批滅菌新第四章-無菌技術連續滅菌是將配制好的培養基向發酵罐等培養裝置輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻等滅菌操作的過程優點：可采用高溫短時滅菌，營養成分破壞少，有利于提高發酵產率發酵罐利用率高；蒸汽負荷均衡；采用板式換熱器時，可節約大量能量；適宜采用自動控制，勞動強度小可根據物料的具體情況，進行分開滅菌，減少物料破壞程度或避免有害物質產生第四節發酵培養基及設備管道滅菌三、連續滅菌新第四章-無菌技術1.連續滅菌的工藝流程先行工作（準備工作）：發酵罐空罐滅菌，加熱器、維持罐和冷卻器先行滅菌。①噴淋冷卻連續滅菌流程（圖4-8）第四節發酵培養基及設備管道滅菌三、連續滅菌②噴射加熱連續滅菌流程（圖4-9）③薄板式換熱器連續滅菌流程（圖4-10）新第四章-無菌技術

培養基在配料罐中通過蒸汽預加熱；用連消泵將培養基送入連消塔，用蒸汽加熱到滅菌溫度；培養基進入維持罐，維持8~25min；培養基經噴淋冷卻器冷卻到發酵溫度后送入發酵罐①噴淋冷卻連續滅菌流程（圖4-8）新第四章-無菌技術②噴射加熱連續滅菌流程（圖4-9）蒸汽直接噴入生培養基經噴射頭進入維持管保溫經膨脹閥進入真空冷卻器冷卻無菌培養基進入發酵罐優點：受熱時間短保證培養基先進先出，避免過熱或滅菌不徹底的現象新第四章-無菌技術③薄板式換熱器連續滅菌流程（圖4-10）培養基進入一級冷卻板預熱到100℃進入加熱板快速加熱到120℃進入維持管保溫后進行二級冷卻無菌培養基進入發酵罐優點：滅菌周期短能耗低新第四章-無菌技術新第四章-無菌技術新第四章-無菌技術四、發酵培養基及設備管道滅菌技術與參數（P71~72）（1）種子罐、發酵罐、計量罐、補料罐等的空罐滅菌及管道滅菌（2）空氣總過濾器和分過濾器滅菌（3）種子培養基實罐滅菌（4）發酵培養基實罐滅菌（5）發酵培養基連續滅菌（6）補料實罐滅菌注意：防止出現死角保證蒸汽壓力和維持時間達到預定值液面以下閥門通蒸汽液面以上閥門排蒸汽第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術空罐滅菌

空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當培養基（或物料）尚未進罐前對罐進行預先滅菌，為空罐滅菌。為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時間較長，只有這樣才能殺死設備中各死角殘存的雜菌或芽孢。四、發酵培養基及設備管道滅菌技術與參數第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術實罐滅菌

將培養基置于發酵罐中用蒸汽加熱，達到預定滅菌溫度后，維持一定時間，再冷卻到發酵溫度，然后接種發酵，這叫做實罐滅菌，又稱分批滅菌。操作要點：三路進汽：直接蒸汽從通風、取樣和出料口進入罐內直接加熱，直到所規定的溫度，并維持一定的時間。這就是所謂的“三路進汽”。

四、發酵培養基及設備管道滅菌技術與參數第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術第五節空氣除菌一、空氣除菌的必要性和重要性

在好氧培養過程中需要供應大量的空氣，而空氣含有大量的微生物，故必須進行空氣除菌以獲得大量的無菌空氣，否則造成嚴重后果；空氣帶菌是發酵染菌的主要原因之一，因此空氣除菌是好氧培養過程的一個重要環節新第四章-無菌技術工業發酵對空氣處理的要求隨發酵產品和菌種不同而異。半固體制曲和酵母生產中無菌要求不十分嚴格，一般無需復雜的空氣凈化處理；密閉的深層通氣發酵需嚴格的純培養，進入發酵罐前空氣必須進行冷卻、脫水、脫油和過濾除菌等處理。發酵對無菌空氣的要求是：無菌、無灰塵、無雜質、無油，溫度和相對濕度合適，具有一定的壓力發酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設計中一般要求1000次使用周期中只允許有一個菌通過，即經過濾后空氣的無菌程度為N=10-3第五節空氣除菌二、發酵對無菌空氣的要求

新第四章-無菌技術空氣過濾除菌

是采用定期滅菌的過濾介質來阻截流過的空氣中所含微生物而制得無菌壓縮空氣的過程從可靠性，經濟適用與便于控制等方面考慮，目前以介質過濾法較好，也是大多數發酵廠廣泛采用的方法。輻射殺菌、加熱殺菌、靜電除菌、過濾除菌

最常用最經濟過濾除菌的缺點是無法去除其中的病毒和噬菌體第五節空氣除菌三、空氣除菌的方法新第四章-無菌技術種類：棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、有機或無機燒結材料（燒結金屬、燒結陶瓷）形狀：纖維狀物、顆粒狀物第五節空氣除菌四、空氣過濾介質新第四章-無菌技術第五節空氣除菌五、空氣過濾除菌的一般流程及相應的設備新第四章-無菌技術前置空氣過濾器進行粗濾空壓機升壓一級冷凝器對壓縮空氣降溫二級甚至多級冷凝器降溫除水、除油空氣加熱器加熱、降低濕度空氣儲罐穩壓空氣過濾器除菌無菌空氣進入發酵罐第五節空氣除菌五、空氣過濾除菌的一般流程及相應的設備新第四章-無菌技術發酵生產中制備無菌空氣的大致過程第五節空氣除菌五、空氣過濾除菌的一般流程及相應的設備新第四章-無菌技術①要制備較高無菌程度，具有一定壓力的無菌空氣，它的流程設備有空氣壓縮機；②附屬設備要求盡量采用新技術，提高效率，減少設備，降低設備投資、運轉費用和動力消耗，簡便操作；③在壓縮機油耗嚴重的設備流程中，要盡可能消除油的影響，可采用無油潤滑的往復式壓縮機來克服；④高溫的壓縮空氣冷卻時會析出大量的冷凝水，必須除去；⑤冷卻和除水除油的措施，可根據各地的環境氣候條件而定。第五節空氣除菌六、對空氣過濾除菌流程的要求新第四章-無菌技術⑥流程的制定應根據發酵特點、所在地的地理環境、氣候條件綜合考慮：在環境污染比較嚴重的地方，要考慮改變吸風的條件，以降低過濾器的負荷，提高空氣的無菌程度；在溫暖潮濕的南方，要加強除水設施，以確保過濾器干燥以發揮最大除菌效率。第五節空氣除菌六、對空氣過濾除菌流程的要求新第四章-無菌技術發酵工廠所使用的空氣除菌流程隨各地的氣候條件不同而有很大的差別！總目標：保持過濾器有較高的過濾效率措施：要有一系列冷卻、分離、加熱設備來保證空氣在相對濕度為50%-60%的條件下通過過濾器，保持不受受油、水的干擾，并維持一定的氣流速度第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（1）兩級冷卻、加熱過濾除菌流程（圖4-11）第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（1）兩級冷卻、加熱過濾除菌流程（圖4-11）從高位吸風塔1將吸入的空氣經粗過濾器

2過濾后進入空壓機3

被壓縮進入貯罐4

，壓縮空氣經第一級冷卻器5冷卻到30~35℃，大部分水結成較大的霧粒，被旋風分離器6分離；再經第二級冷卻器7冷卻到20~25℃，析出一部分較小霧粒，被網絲分離器8分離；除水后的壓縮空氣進入加熱器9加熱，使相對濕度從100%降到50%~60%，以保證過濾介質的干燥及過濾器10的正常運行。第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（1）兩級冷卻、加熱過濾除菌流程（圖4-11）工藝評價：這是一個比較完善的空氣過濾除菌流程，能充分地冷卻并進行空氣和冷凝水的分離，使空氣達到合理的溫度和低的相對濕度后進入過濾器，以提高過濾效率。作為壓縮空氣的標準處理流程，該工藝尤其適用于南方潮濕地區。特點：兩次冷卻、兩次分離、適當加熱兩次冷卻、兩次分離的好處是能有效地控制壓縮空氣的溫度和相對濕度，幾乎適用于各種氣候條件的不同地區第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（2）一級冷卻析水、加熱過濾除菌流程適用于中等濕含量的地區第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（3）一級冷卻過濾除菌流程適用于北方和內陸氣候干燥地區。只保留一級冷卻設備，將壓縮空氣冷卻到露點以上，就直接進入過濾器第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（4）一級冷卻、冷熱空氣直接混合式的空氣過濾除菌流程適用于中等濕含量的地區。熱能利用比較合理第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術（5）一級冷卻、空氣熱交換器加熱式的空氣過濾除菌流程適用于中等濕含量的地區。熱能利用比較合理第五節空氣除菌七、空氣過濾除菌流程的分析新第四章-無菌技術空氣進入過濾器前的處理操作統稱為空氣的預處理，包括前置過濾、壓縮、壓縮空氣的冷卻、除水和除油、再加熱。空氣預處理是過濾器效率正常發揮的重要保證?。?）外源空氣的前過濾提高空氣壓縮前的潔凈度的主要措施有：提高空氣吸氣口的位置和加強吸入空氣的前過濾。第五節空氣除菌八、空氣預處理前置過濾器的作用及要求是什么？（P73）新第四章-無菌技術（1）外源空氣的前過濾前過濾：空氣通過設置在吸入口處的粗過濾器（前置過濾器）的過濾，其作用是減小壓縮機的磨損和主過濾器的負荷，提高除菌空氣的效率和質量對前置過濾器的要求是：過濾效率高、阻力小常用布袋過濾器、填料過濾器第五節空氣除菌八、空氣預處理新第四章-無菌技術（2）空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻空氣壓縮的目的：克服輸送過程中過濾介質等的阻力常用的空壓機有：渦輪式和往復式。通常采用無油的空壓機，以減小后續空氣預處理的難度壓縮空氣冷卻的目的：避免引起過濾介質炭化或燃燒，減小發酵罐的降溫負荷第五節空氣除菌八、空氣預處理新第四章-無菌技術壓縮空氣的冷卻：

空氣的壓縮過程可以近似地看作絕熱壓縮過程，壓縮的空氣溫度與被壓縮的溫度有關：新第四章-無菌技術壓縮空氣的冷卻T1、T2—壓縮前后，空氣的熱力學溫度（K）；P1、P2—壓縮前后，空氣的絕對壓強（Pa）；K—絕熱指數，空氣為1.4。若壓縮為多變過程，則可用多變指數m（對于空氣可取1.2-1.3）.代替絕熱指數K。新第四章-無菌技術壓縮空氣的冷卻例：200C的空氣由1x105Pa被壓縮到4x105Pa（絕壓），求壓縮空氣的溫度。T=403-273=130(0C)。新第四章-無菌技術壓縮空氣的冷卻如果壓縮比更大，壓縮空氣的溫度就更高。如此高溫度的壓縮空氣若直接進入空氣過濾器，極有可能引起過濾介質的炭化或燃燒，而且增大了發酵罐的降溫負荷，給培養溫度的控制帶來困難。另外，高溫度空氣還會增加發酵液水分的蒸發，影響菌體生長。因此壓縮空氣進入介質過濾器前必須降溫。新第四章-無菌技術（3）壓縮空氣冷卻后的除水、除油除水、除油的目的：避免過濾介質受潮失效幾個與濕空氣相關的重要概念：

空氣的絕對濕度：1m3濕空氣中含有水蒸汽的絕對量（kg）

空氣的相對濕度：空氣的絕對濕度與同溫度下飽和絕對濕度的比值或者空氣中水蒸氣分壓與同溫度時的飽和水蒸氣壓的比值

空氣的濕含量：1kg干空氣中含有的水汽量（kg/kg干空氣）

露點Td：當空氣相對濕度為100%，水蒸氣達到飽和時的溫度第五節空氣除菌八、空氣預處理新第四章-無菌技術壓縮空氣冷卻后的除水、除油

大氣中總有一定量的水分，并以氣態存在，當空氣中的水蒸氣過多，超出飽和度（即相對濕度100%）時，或在空氣冷卻至露點以下時，空氣中的水蒸氣才會形成水滴柝出。新第四章-無菌技術壓縮空氣冷卻后的除水、除油空氣的濕含量（或絕對濕含量）X:1kg干空氣中所含水蒸氣的質量（kg）即：Mw、Mg—水和空氣的相對分子量；Pg—干空氣的分壓；P—濕空氣的總壓強（Pa）。新第四章-無菌技術壓縮空氣冷卻后的除水、除油在空氣濕含量不變，即壓縮前后濕含量不變即X1=X2。根據以上公式進行整理得：新第四章-無菌技術（4）壓縮空氣的再加熱和穩壓壓縮空氣再加熱的目的：降低壓縮空氣的相對濕度，防止過濾介質受潮而喪失過濾效能。注意：壓縮空氣加熱溫度的選擇對保證過濾器的除菌效率很重要！一般來說，冷凝后的溫度與再升溫后的溫度相差在10~15℃，即能保證空氣的相對濕度降至50%~60%，能滿足進入過濾器的要求?？諝鈨薜淖饔檬牵悍€壓并使空氣中的剩余液滴在罐內沉降除去第五節空氣除菌八、空氣預處理新第四章-無菌技術棉花：纖維細長，16-20um，填充150-200kg/立方米玻璃纖維：直徑8-19um，直徑越小越好，但小易斷，缺點：更換時碎末飛揚，是過敏源活性炭：大表面，物理吸附，空氣阻力小，常夾帶在二層棉花中降低阻力，為整個過濾器的1/3-1/2超細玻璃纖維紙:以攔截為主，直徑1-1.5um，有較高過濾效率。缺點為強度差，受溫后纖維松散。只用于分過濾器。可加入木漿纖維或其他纖維或采用樹脂并加疏松劑。石棉濾板：藍石棉20％加80％紙將混合打漿。溫強度大，過濾效率低，耐蒸氣反復殺菌。燒結材料過濾介質：聚乙烯醇過濾板。新型過濾介質：微孔濾膜九、空氣過濾介質新第四章-無菌技術鑒于目前所采用的過濾介質均需要在干燥條件下才能進行除菌，因此需要圍繞介質來提高除菌效率。影響介質過濾效率的因素介質過濾效率與介質纖維直徑關系很大，在其他條件相同時，介質纖維直徑越小，過濾效率越高。對于相同介質，過濾效率與介質濾層厚度、介質填充密度和空氣流量有關。第五節空氣除菌十、提高過濾除菌效率的措施新第四章-無菌技術（1）針對不同地區，設計合理的空氣預處理設備，選擇合適的空氣凈化流程，以達到除油、水和雜質的目的。（2）設計和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質。（3）保證進口空氣清潔度，如加強生產場地衛生管理，正確選擇進風口及其高度，加強空氣壓縮前的預處理。（4）降低進入空氣過濾器的空氣相對濕度，如使用無油潤滑的空氣壓縮機，加強空氣冷卻和去油、去水，適當提高進入過濾器的空氣溫度。第五節空氣除菌十、提高過濾除菌效率的措施新第四章-無菌技術第四章發酵工業無菌技術與污染防治第一節概述第二節發酵工業污染的防治策略第五節空氣除菌第三節發酵工業的無菌技術第四節發酵培養基及設備管道滅菌新第四章-無菌技術本章小結染菌對發酵生產影響很大，是否純種培養直接關系到現代發酵工業生產過程的成敗。發酵過程的不同階段，染菌所帶來的影響不同，處理措施也不一樣。如何及早發現雜菌并及時處理事避免染菌造成嚴重損失的重要手段。種子帶菌、空氣帶菌、設備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤和技術管理不善等是造成各個發酵廠污染雜菌的普遍原因。發酵工業的無菌技術各有優缺點，必須注意選擇使用。新第四章-無菌技術6.濕熱滅菌法是發酵工業中大量培養基和發酵設備滅菌最有效最常用的方法。7.培養基滅菌的要求是既要達到滅菌目的，又要使培養基組成成分的破壞減少至最低。8.恰當掌握加熱溫度和受熱時間是滅菌工作的關鍵。9.影響培養基滅菌效果的因素很多，包括雜菌的種類、數量、滅菌溫度、時間，培養基成分、pH、物理狀態、泡沫等。10.培養基分批滅菌也稱實罐滅菌，其過程包括升溫、保溫和冷卻三個階段。滅菌的可靠性主要在保溫階段進行。11.培養基采用連續滅菌時，必須先對發酵罐、加熱器、維持罐、和冷卻器進行滅菌新第四章-無菌技術12.

空氣除菌是好氧培養過程中的一個重要環節。對無菌空氣的要求是：空氣無菌、溫度和相對濕度合適、具有一定壓力。13.空氣預處理是保證過濾器效率能否正常發揮的重要部分?？諝忸A處理包括：前置過濾、壓縮、冷卻、除水、除油、穩壓、再加熱。14.制定空氣過濾除菌流程的依據是：發酵特點、所在的地理環境、氣候條件。新第四章-無菌技術本章思考題現代發酵工業為什么一般都要進行滅菌和消毒？檸檬酸發酵中期染菌如何處理？舉例說明雜菌污染對發酵產物提取和產品質量的影響。試述谷氨酸發酵中感染噬菌體、污染好氣性雜菌或非好氣性雜菌時，溶解氧的變化情況。在實際生產中利用尾氣分析儀檢測尾氣中的二氧化碳的含量變化可以判斷污染情況，其依據是什么？6.在發酵工業中造成染菌的普遍原因是什么？7.噬菌體污染的主要根源是什么？防治的策略和措施有哪些？8.試述不同發酵時期染菌對發酵的影響及處理措施。新第四章-無菌技術9.為什么說恰當掌握加熱溫度和受熱時間是滅菌工作的關鍵？10.試簡述濕熱滅菌的原理。11.試述培養基滅菌時一般選擇高溫快速滅菌法的理論依據。12.試述影響培養基滅菌的因素。13.簡述空氣除菌的必要性和重要性。14.寫出空氣過濾除菌的一般流程和相應的設備。15.舉例說明在制定空氣過濾除菌流程時應考慮的問題。16.在海南要提高空氣除菌效率可采用哪些措施？為了保證空氣過濾器有較高的過濾效率，需要有什么樣的設備支撐？為什么說空氣預處理是保證過濾器效率能否正常發揮的重要部分？新第四章-無菌技術新第四章-無菌技術二、過濾除菌設備原理

概述：

目前發酵工廠采用的空氣過濾設備大多數是傳統的深層過濾設備，濾層厚度一般為1～2米，所用的過濾介質一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纖維、焦炭等。對不同的材料，材料的不同規格，材料的填充情況不同，都會得到不同的過濾效果。為了制取適合要求的無菌空氣，就得深入研究深層過濾的各種關系。新第四章-無菌技術（一）深層過濾原理深層過濾所用的過濾介質—棉花的纖維直徑一般為16~20微米。充填系數為8%時，棉花纖維所形成網格的孔隙為20～50微米，微粒大小為(0.5-2微米)。微粒隨氣流通過濾層時，濾層纖維所形成的網格阻礙氣流前進，使氣流出現無數次改變運動速度和運動方向，繞過纖維前進；這些改變引起微粒以對濾層纖維產生慣性沖擊、阻攔、重力沉降、布朗擴散、靜電吸引等作用而把微粒滯留在纖維表面上。新第四章-無菌技術纖維介質阻留微粒的機制1．阻攔截留：微粒隨空氣氣流向前運動，當氣流為層流時，隨氣流運動的粒子在接近纖維表面的部分由于與過濾介質接觸而被纖維吸附捕集，這種作用稱之為阻攔截留?？諝饬魉儆?，纖維直徑愈細，阻攔截留作用愈大。但是在介質過濾的除塵除菌中，阻攔截留并不起主要作用。2．慣性碰撞截留：空氣氣流流速大時，氣流中的微粒具有較大的慣性力。當微粒隨氣流以一定速度向纖維垂直運動因受纖維阻擋而急劇改變運動方向時，由于微粒具有的慣性作用使它們仍然沿原來方向前進碰撞到纖維表面，產生摩擦粘附而使微粒被截留在纖維表面，這種作用稱慣性碰撞截留。新第四章-無菌技術

截留區域的大小決定于微粒運動的慣性力，所以，氣流速度愈大，慣性力大，截留效果也愈好。此外，慣性碰撞截面作用也與纖維直徑有關，纖維愈細，捕集效果愈好。慣性碰撞截面在介質除塵中起主要作用。3．布朗擴散運動：直徑小于1μ的微粒在運動中往往產生—種不規則的布朗運動，使微粒間相互凝集成較大的粒子，從而發生重力沉降或被介質敲留。但是這種作用只有在氣流速度較低時才較顯著。纖維介質阻留微粒的機制新第四章-無菌技術４.重力沉降作用機理重力沉降是一個穩定的分離作用，當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。就單一的重力沉降情況下，大顆粒比小顆粒作用顯著，對于小顆粒只有在氣流速度很慢時才起作用。一般