代替GB/T18936—2003Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會GB/T18936—2020 I 4臨床診斷 2 2 7血凝和血凝抑制試驗 38禽流感病毒RT-PCR試驗 49禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗 10綜合判定 6附錄A(規范性附錄)試驗所用溶液和1%雞紅細胞的配制 7附錄B(資料性附錄)高致病性禽流感病毒IVPI測定試驗 8附錄C(資料性附錄)血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法 附錄D(資料性附錄)禽流感病毒RT-PCR試驗用引物 附錄E(資料性附錄)RT-PCR反應液配制 附錄F(資料性附錄)實時熒光RT-PCR引物探針序列及反應液配方 IGB/T18936—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準代替GB/T18936—2003《高致病性禽流感診斷技術》,與GB/T18936—2003相比，主要技術變化如下：——增加了禽流感病毒RT-PCR試驗(見第8章);-——增加了禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗(見第9章);——刪除了瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)試驗(見2003年版的第4章);(見2003年版的第5章)。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由中華人民共和國農業農村部提出。本標準由全國動物衛生標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口。本標準起草單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中華人民共和國北京海關、中國動物衛生與流行病學中心。陳化蘭。本標準所代替標準的歷次版本發布情況為：1GB/T18936—2020高致病性禽流感診斷技術1范圍試驗，禽流感病毒RT-PCR試驗和禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗的技術要求。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T765高致病性禽流感樣品采集、保存及運輸技術規范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的以禽類為主的急性傳染病。血凝hemagglutinin;HA流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白，具有識別紅細胞表面受體并使紅細胞凝集的特性。血凝抑制hemagglutinininhibition;HI抗體特異性地附著在HA分子的抗原位點上，干擾流感病毒HA與紅細胞受體之間的結合，抑制了流感病毒HA凝集紅細胞的能力。反轉錄聚合酶鏈式反應reversetranscription-polymerasechainreaction;RT-PCR一種用于放大擴增特定的RNA片段的分子生物學技術。先用RNA反轉錄為cDNA,然后以cDNA為模板進行PCR擴增的過程。實時熒光RT-PCRreal-timeRT-PCR利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程的一種擴增核酸方法。3.6每個反應管內的熒光信號量達到設定的閾值所經歷的循環次數。2GB/T18936—20204臨床診斷5.2.1采集咽喉拭子時將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮2次～3次并旋轉，取分泌液。5.2.2采集泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔至少旋轉3圈并沾取少量糞便。5.2.3將采樣后的拭子分別放入盛有1.2mL樣品稀釋液(配制方法見附錄A中的A.1)的2mL采樣用于HI檢測。3GB/T18936—20205.5樣品保存和運輸樣品采集后置保溫箱中，加入預冷的冰袋，密封，宜24h內送實驗室。樣品應盡快處理，沒有條件的可在4℃存放不超過4d,也可在低溫條件下保存(—70℃貯存為宜)。6病毒分離與鑒定6.1適用范圍病毒分離與鑒定方法適用于對HPAI的病原學診斷，應在有資質的高等級生物安全實驗室操作，按照GB19489的規定執行。6.2樣品處理將棉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子；糞便、研碎的組織加樣品稀釋液充分研磨，按照1g組織加10mLPBS的比例配成懸液。樣品液經3000r/min離心10min,取上清作為接種或者核酸檢測材料。6.3樣品接種及收獲取處理好的樣品，以0.2mL/胚的量經尿囊腔途徑接種9d～11d無特定病原體雞胚，每個樣品接種3～5枚雞胚，在37℃孵化箱內孵育，每天上午和下午定點觀察雞胚死亡情況。無菌收取死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測HA活性。6.4病毒鑒定若無HA活性，則收取尿囊液進行盲傳，至少盲傳1代，若仍陰性，則認為病毒分離陰性；若有HA活性說明可能有正黏病毒科的流感病毒，可進一步采用血凝和血凝抑制試驗(見第7章)、高致病性禽流感病毒IVPI(靜脈內接種致病指數)測定試驗(參見附錄B)、禽流感病毒RT-PCR試驗(見第8章)、禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗(見第9章)等方法進行驗證。7血凝和血凝抑制試驗7.1適用范圍血凝和血凝抑制試驗適用于血凝素亞型的診斷和抗體效價測定。7.2試劑7.2.21%雞紅細胞懸液，配方參見A.3。7.2.3pH7.2、0.01mol/LPBS,配方參見A.4。7.2.4禽流感病毒血凝素分型標準抗原、標準陽性血清、陰性血清。7.3HA試驗(微量法)試驗步驟7.3.1在96孔V型微量反應板中，每孔加0.025mLPBS。7.3.2第1孔加0.025mL抗原或病毒液，反復吹吸3次～5次混勻。7.3.3從第1孔吸取0.025mL抗原或病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，進行2倍系列稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄去。第12孔為PBS對照孔。4GB/T18936—20207.3.4每孔加0.025mLPBS。7.3.5每孔加入0.025mL1%(體積分數)雞紅細胞懸液。7.3.6結果判定。輕扣反應板混合反應物，室溫(約20℃)靜置40min,環境溫度過高時可在4℃條件下靜置60min,當對照孔的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。判定時，將反應板傾斜60°,觀察紅細胞有無淚珠狀流淌，完全無淚珠樣流淌(100%凝集)的最高稀釋倍數判為血凝效價。7.4HI試驗(微量法)試驗步驟7.4.1根據HA試驗測定的效價配制4個血凝單位(即4HAU)的病毒抗原。4HAU抗原應根據檢驗結果調整準確。示例：如果血凝的終點滴度為1:256(2?或8log2),則4HAU=256/4=64(即1:64);取PBS6.3mL,加抗原稀釋，使最終稀釋度為1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。從每一稀釋度中取0.025mL,加入PBS0.025mL,再加入1%雞紅細胞懸液0.025mL,混勻。將血凝板在室溫(約20℃)條件下靜置40min或4℃60min,如果配制的抗原液為4HAU,則1:4稀釋度將出現凝集終點；如果高于4HAU,可能1:5或1:6為終點；如果低于4HAU,可能1:2或1:3為終點。7.4.2第1孔～第11孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05mLPBS作為空白對照。7.4.3第1孔加入0.025mL血清(鴨、鵝血清在檢測時建議進行預處理，參見附錄C);第1孔血清與PBS充分混勻后吸取0.025mL于第2孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。第11孔作為抗原對照。7.4.4第1孔～第11孔均加入0.025mL4HAU抗原，在室溫(約20℃)下靜置30min或4℃4℃60min,空白對照孔(12孔)紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。7.4.6結果判定。當抗原對照孔(第11孔)完全凝集，且陰性對照血清抗體效價不高于1:4(22或2log2),陽性對照血清抗體效價與已知效價誤差不超過1個滴度時，試驗方可成立。以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI抗體效價。用于檢測抗體，檢測雞血清時，HI抗體效價不高于1:8(23或3log2)判為陰性，不低于1:16(2?或4log2)判為陽性。用于檢測抗原，能夠被某亞型禽流感標準血清抗體抑制，HI效價不低于1:16(2?或4log2)時判定為該亞型陽性；HI抗體效價不高于1:8(23或3log2)判為陰性。對于疑似H5亞型等抗原性可能存在較大差別的病毒，應結合其他病毒檢測方法進行鑒定。8禽流感病毒RT-PCR試驗8.2.1PCR擴增儀及配套反應管。8.2.2高速臺式冷凍離心機(離心速度不低于12000r/min)。8.2.4微量移液器(5μL、10μL、100μL、1000μL)及5GB/T18936—20208.2.7紫外凝膠成像儀。8.3.1推薦的禽流感病毒RT-PCR引物序列，參見附錄D。8.3.2RT-PCR反應液，配方參見附錄E的E.1。8.3.3無核酸酶水，配方參見E.2。8.3.4無水乙醇。8.3.5陰性對照為SPF雞胚尿囊液。8.3.6陽性對照為滅活的相應亞型禽流感病毒胚培養物。8.4RNA提取可選市售商品化RNA提取試劑盒，按說明書進行。8.5RT-PCR操作轉錄45min;94℃預變性2min;94℃30s、52℃45s、68℃45s,35個循環；最后68℃延伸8min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。8.7結果判定在陽性對照出現相應擴增帶、陰性對照無此擴增帶時判定結果。出現預期大小的擴增片段時，判定9禽流感病毒實時熒光RT-PCR試驗9.1適用范圍9.2儀器設備9.2.1熒光PCR儀。9.2.2其余器材同8.2.2～8.2.4。9.3試劑及引物探針序列推薦的實時熒光RT-PCR引物探針序列參見附錄F的F.1。9.4樣本核酸的提取可選市售商品化RNA提取試劑盒，按說明書進行。9.5實時熒光RT-PCR操作9.5.1實時熒光RT-PCR擴增試劑的準備與配制宜在專門的反應混合物配制區配制實時熒光RT-PCR擴增試劑。根據需要檢測的樣品數，按推薦6GB/T18936—2020的實時熒光RT-PCR反應液配方(參見F.2)配制反應液，充分混勻后分裝，每個反應管15pL。轉移反應管至樣本制備區。宜在專門的樣本制備區進行。在9.5.1配好的反應管中分別加入9.4中制備的RNA溶液5pL(約500ng),使每管總體積達到20μL,記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋后，500r/min9.5.3實時熒光RT-PCR反應設定宜在專門的檢測區進行實時熒光RT-PCR反應。將9.5.2中加樣后的反應管放入實時熒光RT-PCR檢測儀內，編輯樣品表后，選定與探針標記熒光基團相符合的檢測通道讀取熒光信號值，淬滅基團選擇none。推薦的實時熒光RT-PCR反應參數設定參見F.3。9.6結果判定綜合分析儀器讀取的各項數據及擴增曲線，設定合理的閾值(threshold)和基線(baseline),使儀器顯示正確的結果。9.6.2.1陰性對照檢測通道讀取數據無Ct值或Ct值>35并且無特征性擴增曲線。9.6.2.2陽性對照檢測通道讀取數據出現特征性擴增曲線，且Ct值應≤30。9.6.2.3如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次試驗視為無效。9.6.3.1若測定樣品Ct值≤30,判為所用引物探針禽流感病毒特定型或亞型核酸陽性。9.6.3.2若測定樣品30<Ct值≤35,判為可疑。重復測定后仍在可疑區間的樣本判為陽性。9.6.3.3若測定樣品無Ct值或Ct值>35,判為陰性。出現4.2、4.3中的情況，初步判為高致病性禽流感臨床疑似病例，若其H5或H7亞型的RT-PCR或實時熒光RT-PCR檢測陽性，可判為高致病性禽流感疑似病例。病毒分離物經HA和HI試驗確定為流感病毒，且分離物的IVPI值大于1.2,判定為高致病性禽流感病毒；如果IVPI值小于1.2的H5或H7亞型禽流感病毒，在HA裂解位點處具有與HPAI病毒相似的氨基酸序列，亦判定為高致病性禽流感病毒。分離到高致病性禽流感病毒的病例判定為高致病性禽流感確診病例。7GB/T18936—2020(規范性附錄)試驗所用溶液和1%雞紅細胞的配制A.1樣品稀釋液樣品稀釋液的配制方法如下：a)A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液。NaH?PO?·H?O27.6g,溶于蒸餾水中，最后定容至或Na?HPO?·2H?O35.6g,加蒸餾水溶解，最后定容至1000mL。c)0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)(含抗生素和穩定劑)的配制。取A液14mL,B液36mL,加NaCl8.5g,用蒸餾水定容至1000mL。經121℃±2℃、15min高壓滅菌，冷卻抑制素(1000U/mL)和牛血清白蛋白(5mg/mL)。上述抗生素濃度宜用于組織和咽喉拭子，如果用作糞便和泄殖腔拭子的緩沖液，抗生素濃度可提高A.2阿氏(AIsevers)液配制A.31%雞紅細胞懸液采集至少三只SPF雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/LPBS洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min,洗滌后用PBS配成1%(體積分A.4pH7.2,0.01mol/LPBS的配制pH7.2,0.01mol/LPBS的配制方法如下：a)配制25×PB:稱量2.74g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至100mL。b)配制1×PBS:量取40mL25×PB,加入8.5g氯化鈉，加蒸餾水至1000mL。c)用氫氧化鈉或鹽酸調pH至7.2。d)滅菌或過濾。e)PBS一經使用，于4℃保存不超過3周。8GB/T18936—2020(資料性附錄)高致病性禽流感病毒IVPI測定試驗B.1試驗雞6周齡SPF雞，10只。B.2接種材料感染雞胚的尿囊液，血凝價在1:16(2?或4log2)以上，未混有任何細菌、霉菌、支原體或其他病毒。B.3接種方法將感染雞胚尿囊液用PBS1:10稀釋，以0.1mL/羽的劑量翅靜脈接種。每日觀察每只雞的發病B.4記錄方法根據每只雞的癥狀用數字方法每天進行記錄：正常雞記為0,病雞記為1,重病雞記為2,死雞記列舉1個假設試驗來說明IVPI的計算方法，參見表B.1和公式(B.1)。表B.1假設高致病性禽流感病毒致病性試驗記錄結果臨床癥狀第1天分類總計得分533210000000000000000005201110000057789總計——————注1:當IVPI值大于1.2時，判定分離株為高致病性禽流感病毒(HPAIV)。注2:本試驗中IVPI=(0+0+20+198)/100=2.18>1.2,因此，本試驗中的分離株為HPAIV。B.5IVPI值計算IVPI值計算參見公式(B.1):9GB/T18936—2020…(B.1)∑a——10d累計正常雞數；∑b——10d累計病雞數；∑.——10d累計重病雞數；∑d—10d累計死雞數；T——10d累計記錄10只雞的總次數，即100。B.6判定標準B.6.1當IVPI值大于1.2時，判定此分離株為高致病性禽流感(HPAI)病毒株。B.6.2當IVPI值小于1.2時，H5和H7亞型的禽流感病毒應進行血凝素裂解位點的序列分析，如果氨基酸序列同其他高致病性流感病毒相似，被檢測的分離物應被視為高致病性禽流感病毒。GB/T18936—2020(資料性附錄)體方法為：每0.5mL血清中加入0.025mL50%雞紅細胞，輕搖后靜置至少30min,800g離心2min~5min,收集上清液(處理后的血清)。用上清液進行HI試驗時，需設處理陽性血清對照。或者可用與待檢血清宿主來源相同的1%紅細胞懸液進行HA和HI試驗。C.2非特異性抑制因子的處理C.2.1胰酶—加熱一高碘酸鹽法利用胰酶—加熱—高碘酸鹽法處理非特異性抑制因子的操作如下：0.01mol/L、pH值7.0～7.2的PBS中，混勻，過濾除菌，分裝并在-15℃以下保存，保存期b)再加入0.9mL高碘酸鉀(將230mgKIO?用0.01mol/L、pH值7.0～7.2的PBS定容至c)再加入0.9mL的丙三醇鹽溶液(1mL丙三醇加入99mL的0.01mol/L、pH值7.0～7.2的d)最后加入0.75mL生理鹽水，混勻，置4℃保存備用。處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。C.2.2受體破壞酶(RDE)處理法利用RDE處理法處理非特異性抑制因子的操作如下：a)取1體積血清(50μL),加4體積RDE(200μL),37℃水浴18h(過夜)。b)再加入5體積(250μL)的1.5%濃度的檸檬酸鈉，混勻，置56℃水浴30min(以破壞殘余的RDE活性)。c)將1體積的50%的紅細胞加入到10體積RDE處理的血清中(50μL紅細胞+500μL血清),振蕩混勻后4℃放置1h,期間可輕輕搖勻懸浮紅細胞數次。d)1000g離心10min,小心吸取上層上清，用于檢測。處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。處理后血清HI試驗方法如下：a)第2孔～第11孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05mLPBS作為空白對照。b)第1孔、第2孔加入處理后的血清0.025mL,第2孔血清與PBS充分混勻后吸0.025mL于第3孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。第11孔為抗原對照。c)第1孔～第11孔均加入0.025mL4HAU抗原，在室溫(約20℃)下靜置40min或4℃GB/T18936—2020d)每孔加入0.025mL1%(體積分數)雞紅細胞懸液，震蕩混勻，在室溫(約20℃)下靜置40min或4℃60min,對照孔紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。e)結果判定。當陰性對照血清抗體效價不高于1:10,陽性對照血清抗體效價與已知效價誤差不超過1個滴度時，試驗方可成立。以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI抗體效價。被檢血清HI抗體效價低于1:10判為陰性，不低于1:10判為陽性。(資料性附錄)禽流感病毒RT-PCR試驗用引物采用普通RT-PCR方法開展禽流感檢測，可根據檢測目的基因不同選擇引物(參見表D.1)。表D.1禽流感病毒RT-PCR試驗可選擇的引物引物名稱引物序列5'—3'長度bp擴增目的基因M-229UTTCTAACCGAGGTCGAAACMM-229LAAGCGTCTACGCTGCAGTCCH5-372UGGAATATGGTAACTGCAACACCAH5H5-372LAACTGAGTGTTCATTTTGTCAATGH7-501UAATGCACARGGAGGAGGAACTH7H7-501LTGAYGCCCCGAAGCTAAACCAH9-273UTGTGTCTTACGATGGGACAAGCAH9H9-273LTTGACAAGAGGCCTTGGTCCTATN1-358UATTRAAATACAAYGGYATAATAACN1N1-358LGTCWCCGAAAACYCCACTGCAN2-377UGTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAGN2N2-377LGAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCAN9-203UATAATGAAACAAACATCACCAAN9N9-203LAGCATAGAACCTGCATTCATCT注：W=(AT);Y=(CT);R=(AG)。GB/T18936—2020(資料性附錄)RT-PCR反應液配制E.1RT-PCR反應體系每個RT-PCR反應體系包括的組分參見表E.1。表E.1RT-PCR反應液配方組分1個檢測體系的加入量5×反應緩沖液15mmol/L氯化鎂20pmol上游引物20pmol下游引物AMV反轉錄酶(200U/μL)TaqDNA聚合酶(5U/μL)無核酶滅菌水E.2無核酸酶水將DEPC加入去離子水中至終濃度為0.1%,充分混合均勻后作用12h,分裝，(121±2)℃高壓滅菌30min,冷卻后冷藏備用。GB/T18936—2020(資料性附錄)實時熒光RT