關于酶工程酶的發酵生產第一節酶生物合成的基本理論第2頁,共68頁，星期六，2024年，5月一、中心法則1958年Crick：DNARNA蛋白質轉錄翻譯ATCGAUCG43=64遺傳密碼氨基酸折疊密碼第3頁,共68頁，星期六，2024年，5月

二、RNA的生物合成——轉錄RNA的種類dsRNA:某些病毒遺傳信息載體催化活性RNA：催化作用tRNA：氨基酸載體rRNA：與蛋白質共同組成核糖體mRNA：蛋白質合成模板sRNA：分子修飾、代謝調節作用（一）RNA的種類和主a要功能第4頁,共68頁，星期六，2024年，5月以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在依賴DNA的RNA聚合酶作用下，生成RNA的過程。（二）轉錄RNA+4nPPinATPnGTPnCTPnUTPDNA模板，Mg2+/Mn2+RNA聚合酶第5頁,共68頁，星期六，2024年，5月大腸桿菌RNA聚合酶：MW=5x105（三）RNA聚合酶全酶：由ββ’αωσ組成，識別轉錄起始位點，與DNA上的啟動基因結合，使轉錄開始。核心酶：由ββ’αω組成，進行核苷酸鏈的延伸。第6頁,共68頁，星期六，2024年，5月真核生物RNA聚合酶：三種聚合酶種類RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶III別名rRNARNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶存在位置核仁核仁核之相對分子質量/103550600600催化反應產物rRNAmRNAtRNA5SrRNA第7頁,共68頁，星期六，2024年，5月RNA生物合成的起始位點在DNA的啟動基因（啟動子)上（四）轉錄的起始起始階段的重要問題是RNA聚合酶與DNA的啟動基因的相互作用，起始階段包括：全酶的形成酶與模板結合酶與啟動基因結合模板DNA局部變性轉錄開始第8頁,共68頁，星期六，2024年，5月RNA轉錄泡，17bpDNA5’3’5’3’活性中心RNA-DNA雜交體，8bp重旋解旋酶的移動方向

（五）轉錄的延伸第9頁,共68頁，星期六，2024年，5月模板DNA分子上每個基因或每個操縱子都含有一個終止信號——終止子。當RNA聚合酶轉錄到達這個信號時，合成的RNA分子以及聚合酶與模板DNA分離，RNA鏈的合成便被終止。（六）轉錄的終止5’ρATP→ADP+PiRNA聚合酶終止子第10頁,共68頁，星期六，2024年，5月1.剪切反應2.剪接反應3.末端連接反應：（七）RNA前體的加工tRNA3’-末端加上CCA-OH尾巴在mRNA的5’-末端加上“帽子”結構5’-m7GpppNmpNp在mRNA的3’-末端連接polyA尾巴tRNA5’-末端加上甲基鳥苷酸核苷修飾反應第11頁,共68頁，星期六，2024年，5月二、蛋白質的生物合成——翻譯以mRNA為模板，以各種氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程，稱為翻譯。DNAaRNA

蛋白質轉錄翻譯ATCGAUCG43=64遺傳密碼氨基酸第12頁,共68頁，星期六，2024年，5月遺傳密碼的簡并性：密碼子

5’-XYZ-3’反密碼子

3’-X’Y’Z’-5’61種密碼——20種氨基酸遺傳密碼的通用性密碼子與反密碼子的相互作用：mRNAtRNACrick根據立體化學原理，于1966年提出了擺動假說：密碼子與反密碼子的配對中，前兩對嚴格按照堿基配對原則，而第三對堿基則可以有一定自由度地擺動，所以，某些tRNA的反密碼子可以識別一個以上的密碼子。第13頁,共68頁，星期六，2024年，5月1.氨基酸活化生成氨酰-tRNAaa＋tRNA+ATPaa-tRNA+AMP+PPi

氨酰-tRAN合成酶

大腸桿菌，肽鏈合成的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸：Met＋tRNAF+ATP→Met-tRNAF+AMP+PPi甲酰轉移酶fMet-tRNA第14頁,共68頁，星期六，2024年，5月2.肽鏈的合成起始30s亞基IF-3mRNAmRNAGTP-IF-2-fMet-tRNAfMRA50s亞基IF-1+IF-2+IF-3GDP+PifMet第15頁,共68頁，星期六，2024年，5月3.肽鏈的延伸mRNAfMetaa2fMetfMetaa1aa1EF-TGTP*aa1EF-TGDP+Piaa1aa1aa1fMettRNA2+EF-G+GDP+Pi+EF-G+GTP+EF-T+GDP+Piaa2+EF-T+GTP+EF-G+GTPtRNA1EF-GGDP+Piaa2fMetfMetaa2aa1fMet第16頁,共68頁，星期六，2024年，5月4.肽鏈的終止終止密碼子：UAA,UAG,UGA釋放因子（ReleaseFactor）:RF-1：UAA,UAGRF-2：UAA,UGA5.翻譯后加工去除甲酰基去除N-末端的氨基酸肽鏈折疊第17頁,共68頁，星期六，2024年，5月三、酶生物合成的調節第18頁,共68頁，星期六，2024年，5月轉錄水平的調節轉錄產物的加工調節翻譯水平的調節翻譯產物的加工調節酶降解調節組成酶：DNA酶，RNA酶，糖酵解途徑的酶調節酶：適應酶，β-半乳糖苷酶（誘導酶）酶的類型酶合成的調節控制第19頁,共68頁，星期六，2024年，5月1960年Jacob和Monod提出的操縱子學說調節基因：產生阻遏蛋白啟動基因操縱基因：與阻遏蛋白結合結構基因：蛋白多肽鏈產物操縱子1.RNA聚合酶結合位點2.cAMP及其受體蛋白復合物（cAMP-CRP）結合位點（一）操縱子學說第20頁,共68頁，星期六，2024年，5月…RPOS1S2……DNA調節基因啟動基因操縱基因結構基因與阻遏蛋白結合1.RNA聚合酶結合位點2.cAMP及其受體蛋白復合物（cAMP-CRP）結合位點產生阻遏蛋白mRNA操縱子第21頁,共68頁，星期六，2024年，5月原核生物中操縱子的類型1.誘導型操縱子：乳糖操縱子2.阻遏型操縱子：色氨酸操縱子第22頁,共68頁，星期六，2024年，5月（二）原核生物中酶生物合成的調節機制1.分解代謝物阻遏作用2.酶生物合成的誘導作用3.酶生物合成的反饋阻遏作用第23頁,共68頁，星期六，2024年，5月1.分解代謝物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是誘導酶）生物合成的現象。cAMP↓+H2OAMP↓磷酸二酯酶葡萄糖過量降解ATPADP,AMPcAMP-CRP↓啟動基因上沒有cAMP-CRP結合酶合成↓例：葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成第24頁,共68頁，星期六，2024年，5月2.酶生物合成的誘導作用加進某種物質，使酶的生物合成開始或加速進行的過程。簡稱為誘導作用，起誘導作用的物質，稱為誘導劑。舉例：乳糖誘導β-半乳糖苷酶的合成…RPOS1S2…DNA無誘導物時：添加誘導物時：…RPOS1S2…DNA誘導物轉錄翻譯mRNA酶乳糖別乳糖第25頁,共68頁，星期六，2024年，5月3.酶生物合成的反饋阻遏作用（產物阻遏作用）是指酶催化作用的產物或代謝途徑的末端產物使該酶的生物合成受阻的過程。引起反饋阻遏的物質，稱為共阻遏物。舉例：無機磷酸阻遏堿性磷酸酶無阻遏物時：添加阻遏物時：…RPOS1S2…DNA翻譯mRNA…RPOS1S2…DNA共阻遏物磷酸單酯磷酸+醇堿性磷酸酶第26頁,共68頁，星期六，2024年，5月（三）真核生物中酶生物合成的調節機制1.細胞分化改變酶的生物合成2.基因擴增加速酶的生物合成3.增強子促進酶的生物合成4.抗原誘導抗體酶的生物合成第27頁,共68頁，星期六，2024年，5月1.細胞分化改變酶的生物合成3’5’5’TTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA3’5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA3’5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA端粒酶催化端粒的延伸（1）結合（2）延伸（3）移位第28頁,共68頁，星期六，2024年，5月2.基因擴增加速酶的生物合成基因擴增：是通過增加基因的數量來調節基因表達的一種方式。例：CHO在含有氨甲蝶呤的培養基上培養編碼二氫葉酸還原酶的基因大量擴增，二氫葉酸還原酶合成速度加快。第29頁,共68頁，星期六，2024年，5月增強子：又稱調變子，是一段能夠高效增強或促進基因轉錄的DNA序列。增強子的重要特性是能夠促進同源或異源啟動基因的轉錄活性，其增強效果有時可達1000倍。3.增強子促進酶的生物合成第30頁,共68頁，星期六，2024年，5月4.抗原誘導抗體酶的生物合成

1948年Pauling提出過渡態理論

1975年Kohler合Milstein發明單克隆抗體技術

1986年Lerner合Schultz分別獨立獲得具有催化活性的抗體第31頁,共68頁，星期六，2024年，5月第二節酶的生物合成法生產第32頁,共68頁，星期六，2024年，5月一、基本概念酶的生物合成：所有的生物體在一定條件下都能夠產生多種多樣的酶。酶在生物體內的產生過程，稱為酶的生物合成。酶的生物合成法生產：經過預先設計，通過人工操作控制，利用細胞（包括微生物細胞、植物細胞和動物細胞）的生命活動，產生人們所需要的酶的過程。第33頁,共68頁，星期六，2024年，5月二、酶的生物合成法生產種類微生物發酵產酶植物細胞培養產酶動物細胞培養產酶第34頁,共68頁，星期六，2024年，5月優良的產酶細胞應具備的條件1.繁殖快,產酶量高，有利于縮短生產周期。2.能在便宜的底物上良好生長。3.產酶性能穩定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。4.產生的酶容易分離純化。5.不是致病菌及產生有毒物質或其他生理活性物質的微生物，才能確保酶生產和應用的安全。第35頁,共68頁，星期六，2024年，5月1.大腸桿菌特征：細胞成桿狀，0.5μm*（1~3）μm，無芽孢，G-，菌落從白色到黃色，光滑閃光，擴展。產酶種類：一般生產胞內酶谷氨酸脫羧酶，天冬氨酸酶，芐青霉素酰化酶，基因工程研究用酶等三、酶發酵生產常用的微生物第36頁,共68頁，星期六，2024年，5月2.枯草芽孢桿菌特征：細胞成桿狀，（0.7~0.8）μm*（2~3）μm，單個，無莢膜，周生鞭毛，運動，G+，菌落粗糙，不透明。污白色或微帶黃色。產酶種類：

α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、堿性磷酸酶等第37頁,共68頁，星期六，2024年，5月3.鏈霉菌特征：最高等的放線菌。有發育良好的分枝菌絲，菌絲無橫隔，分化為營養菌絲、氣生菌絲、65孢子絲。孢子絲再形成分生孢子。孢子絲和孢子的形態、顏色因種而異，是分種的主要識別性狀之一。產酶種類：α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、堿性磷酸酶等第38頁,共68頁，星期六，2024年，5月4.黑曲霉特征：屬于半知菌亞門,菌絲有隔,細胞多核；部分氣生菌絲細胞形成特化的厚壁、膨大的足細胞，由足細胞的中間稍呈垂直地向上延長，形成分生孢子梗。產酶種類：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等第39頁,共68頁，星期六，2024年，5月特征：屬于半知菌亞門,分生孢子梗基部無足細胞，孢子梗頂端不膨大成囊，而是多次分枝形成掃帚狀，小梗末端形成分生孢子。產酶種類：葡萄糖氧化酶、果膠酶、纖維素酶等5.青霉第40頁,共68頁，星期六，2024年，5月四、產酶菌種的篩選方法胞內酶：含菌樣品的采集→菌種分離→產酶性能測定→復篩①固體培養法：把菌種接人固體培養基中,保溫數天,用水或緩沖液浸泡培養基,將酶抽提,測定酶活力,這種方法主要適用于霉菌.②液體培養法：將菌種接人液體培養基后,靜置或在搖床上振蕩培養一段時間(視菌種而異),再測定培養物中酶的活力,通過比較,篩選胞外酶：第41頁,共68頁，星期六，2024年，5月五、酶的發酵生產方式1.固體培養發酵2.液體深層發酵3.固定化細胞4.固定化原生質體發酵第42頁,共68頁，星期六，2024年，5月第四節發酵工藝的條件及控制第43頁,共68頁，星期六，2024年，5月保藏細胞細胞活化細胞擴大培養發酵分離純化酶原生質體培養基固定化原生質體固定化細胞預培養無菌空氣酶發酵生產的一般工藝流程第44頁,共68頁，星期六，2024年，5月一、細胞活化與擴大培養細胞活化：保藏細胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養基上，在一定條件下進行培養，以恢復細胞的生命活力，這就叫細胞的活化。種子培養基：用于細胞擴大培養的培養基。氮源豐富碳源少溫度、pH、溶解氧接種量：1~10%第45頁,共68頁，星期六，2024年，5月二、培養基的配制培養基：是指人工配制的用于細胞培養和發酵的各種營養物質的混合物。碳源氮源無機鹽生長因素第46頁,共68頁，星期六，2024年，5月三、pH調節1.細胞發酵產酶的最適pH與生長最適pH值往往不同，通常接近于該酶反應的最適pH。2.有些細胞可以同時產生多種酶，通過控制培養基的pH，往往可以改變各種酶之間的產量比例。3.培養基的pH在細胞生長繁殖和代謝物產生的過程中往往會發生變化。第47頁,共68頁，星期六，2024年，5月四、溫度的調節控制1.細胞發酵產酶的最適溫度與最適生長溫度有所不同，而且往往低于最適生長溫度。2.有些酶的發酵生產，要在不同階段控制不同的溫度條件。第48頁,共68頁，星期六，2024年，5月五、溶解氧的調節控制調節溶解氧的方法：（1）調節通氣量（2）調節氧的分壓（3）調節氣液接觸時間（4）調節氣液接觸面積（5）改變培養基的性質第49頁,共68頁，星期六，2024年，5月六、微生物產酶的方式及特點1.固體培養發酵優點：設備簡單、操作方便、麩曲中酶濃度較高、適合霉菌培養發酵缺點：勞動強度大、原料利用率低、生產周期長2.液體深層發酵3.固定化細胞4.固定化原生質體第50頁,共68頁，星期六，2024年，5月七、提高酶產量的措施1.添加誘導物酶的作用底物:酶的反應產物:酶的底物類似物:

葡萄糖：1個β-半乳糖苷酶乳糖：3000個半乳糖醛酸誘導果膠酶纖維二糖誘導纖維素酶異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）對β-半乳糖苷酶的誘導效果比乳糖高幾百倍第51頁,共68頁，星期六，2024年，5月2.控制阻遏物的濃度：無機磷是堿性磷酸酶的阻遏物3.添加表面活性劑：增加細胞的通透性4.添加產酶促進劑：聚乙烯醇提高糖化酶的產量機理尚不清楚第52頁,共68頁，星期六，2024年，5月八、酶發酵動力學發酵動力學是研究發酵過程中細胞生長速度、產物生成速度、基質消耗速度以及環境因素對這些速度的影響的學科第53頁,共68頁，星期六，2024年，5月細胞濃度/（mg/mL）酶濃度/(單位/ml)細胞濃度/（mg/mL）OABCDO-A調整期A-B生長期B-C平衡期C-D衰退期時間/hI-同步合成型II-延續合成型III-中期合成型IV-滯后合成型時間/hIIIIIIIV（一）酶生物合成模式第54頁,共68頁，星期六，2024年，5月（二）各種酶生物合成模式的特點1.同步合成型例：單寧誘導米曲霉合成單寧酶1.生物合成可以誘導，但不受分解代謝阻遏物和反應產物阻遏。2.酶所對應的mRNA很不穩定。細胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060細胞濃度總酶濃度胞外酶濃度胞內酶濃度特點：第55頁,共68頁，星期六，2024年，5月2.延續合成型例：果膠誘導黑曲霉合成聚半乳糖酸酶1.生物合成可以誘導，但不受分解代謝阻遏物和反應產物阻遏。2.酶所對應的mRNA很穩定。細胞濃度總酶濃度細胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060特點：第56頁,共68頁，星期六，2024年，5月3.中期合成型例：枯草桿菌合成堿性磷酸酶1.生物合成受反饋抑制。2.酶所對應的mRNA不穩定。細胞濃度酶濃度細胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060特點：第57頁,共68頁，星期六，2024年，5月4.滯后合成型1.酶在對數期不合成。2.酶所對應的mRNA穩定。例：黑曲霉合成酸性蛋白酶細胞濃度酶濃度細胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060特點：第58頁,共68頁，星期六，2024年，5月第五節動、植物細胞發酵產酶第59頁,