全血膽堿酯酶（CHE）活力測定中山大學公共衛生學院824辦公室馮玉超

有機磷酸酯農藥是我國目前生產和使用最多的一類農藥。

對硫磷、內吸磷、馬拉硫磷、樂果、敵百蟲及敵敵畏Q:有機磷中毒機制及臨床表現？有機磷中毒機制及臨床表現抑制體內膽堿酯酶（ChE）活性乙酰膽堿膽堿酯酶有機磷農藥2、煙堿樣癥狀（N受體）1、毒蕈堿樣癥狀（M受體）3、中樞神經系統癥狀頭暈、乏力、意識障礙腺體分泌亢進：多汗、口鼻分泌物增多平滑肌痙攣：呼吸困難、惡心嘔吐、腹瀉瞳孔縮小血壓升高、心動過速運動神經興奮：肌肉震顫、痙攣、無力觀察小鼠染毒后10min的表現

乙酰膽堿酯酶，主要分布于神經系統及紅細胞表面，具有水解乙酰膽堿的特殊功能。全血或紅細胞膽堿酯酶活力測定是有機磷農藥急性中毒分級和慢性中毒的診斷指標。

全血膽堿酶活性范圍：（GBZ8-2002)接觸反應：全血或紅細胞膽堿酯酶活力<70%,無明顯臨床癥狀；

或全血或紅細胞膽堿酯酶活力>70%，有輕度毒蕈堿樣

自主神經癥狀或中樞神經系統癥狀。有機磷農藥急性中毒的分級診斷標準急性輕度中毒50%~70%急性中度中毒30%~50%急性重度中毒<30%結合相應臨床癥狀一、實驗目的3、加深對有機磷農藥中毒機制的理解。1、掌握全血膽堿酯酶活力的測定原理及方法。2、了解膽堿酯酶活性測定在職業有機磷中毒診斷中的意義及應用。二、實驗原理

乙酰膽堿膽堿酯酶膽堿乙酸堿性羥胺乙酰羥胺羥肟酸鐵（棕紅色絡合物）FeCl3HCl吸光度值越大，血液中剩余乙酰膽堿的量越多，膽堿酯酶活性越低實驗試劑及器材

試劑：0.5mg/ml敵敵畏溶液、肝素鈉溶液、蒸餾水、

膽堿酯酶活性測定試劑盒器材：分光光度計、水浴鍋、離心機、微量移液器、1ml注射器、剪刀、1.5mlEP管、15毫升離心管

試劑瓶三、實驗步驟和方法

1、染毒及血樣的采集和制備2、實驗試劑的配置3、反應體系的配置4、樣品的檢測5、結果的分析

1、染毒及血樣的采集和制備實驗動物：小鼠

毒物：敵敵畏染毒劑量：0.1ml/10g

敵敵畏溶液染毒方式：腹腔注射染毒時間：10分鐘

血樣的采集和制備①尾靜脈采血

輕彈小鼠尾巴，酒精棉球消毒，剪尾0.5cm,向尾末端擠壓。②采血時間：染毒前后各采血一次，按下述方法制備血樣標本（取血---染毒---取血）保證染毒前后采血量一致（4滴），采完止血。③血樣標本制備：先用肝素鈉潤洗EP管，取25ul的肝素鈉溶液置于1.5mlEP管管口，①獲得的血與肝素鈉溶液混勻，以獲得50ul的血、肝素鈉混勻液；取50ul血、肝素鈉混勻液與200ul的冷卻蒸餾水混勻，室溫靜置15分鐘，待血液澄清透亮，以備用。

2、實驗試劑的配制按照膽堿酯酶活性測定試劑盒說明配置以下溶液：①8μmol/ml乙酰膽堿應用液；乙酰膽堿粉劑（-20℃，離心）加入到試劑二稀釋液，混勻后所得混合液與試劑一按1:9的比例配。（3ml混合液+27ml試劑一）

②堿性羥胺（試劑三應用液)；試劑三乙液加入到試劑三甲粉劑，混勻后所得試劑與試劑三丙液按1:1配成。

（10ml甲乙混合液+10ml丙液）③FeCl3

溶液（試劑六）；試劑六溶液直接加入到試劑六粉劑。注：上述應用液均需現配現用，試劑一、試劑四、試劑五不用配。

測定管對照管空白管待測樣本（ml)（膽堿酯酶）0.1--蒸餾水（ml）--0.358umol/ml乙酰膽堿應用液（ml)0.250.25-試劑一（ml）（磷酸鹽緩沖液）0.50.50.5混勻，37℃水浴20分鐘試劑三應用液（ml）（堿性羥胺）1.01.01.0試劑四（ml）0.50.50.5試劑五（ml）（鹽酸）0.250.250.25試劑六（ml）（FeCl3)0.50.50.5待測樣本（ml）-0.1-準備5個15ml離心管染毒前：測定管、對照管染毒后：測定管、對照管空白管3、反應體系的配制膽堿酯酶水解乙酰膽堿剩余乙酰膽堿與羥胺及鐵離子反應

4.樣品的檢測1.將上述反應溶液混勻，3000~3500轉/分，離心10分鐘；（棕紅色的上清溶液）2.分光光度計用空白管調零，取上清，于520nm測各管吸光度值。

5.結果的計算和分析計算全血膽堿酯酶活力膽堿酯酶活力：每毫升全血在37℃和底物作用20分鐘，

分解1μmol乙酰膽堿為一個活性單位。計算CHE活力相對值d=染毒后CHE活力/染毒前CHE活力根據膽堿酯酶活力相對值對模型中毒情況進行評價

四、注意事項

正確完成腹腔注射及尾靜脈取血的基本操作，以保證獲得足夠的樣本進行實驗；取出的血滴應及時與肝素鈉溶液混勻，避免血液凝塊的形成；血樣標本制備完成后（血液澄清透亮），應立即與乙酰膽堿反應，防止膽堿酯酶的失活；配制反應體系時注意嚴格按照順序加入各試劑；正確使用分光光度儀進行結果的檢測（加三氯化鐵顯色后，在20min內比色，調零、上清、比色皿）；注意實驗室安全，自身物品遠離實驗臺，防止敵敵畏的誤食、吸入或污染皮膚；實驗報告要求1、實驗目的及意義2、實驗方法：簡單敘述操作步驟3、結果分析a.計算染毒前后全血CHE的活力及其比值；b.根據GBZ8-2002診斷標準，初步診斷該模型有機磷農藥中毒的情況；c.分析影響實驗成敗的因素。實驗流程稱重采血血樣制備配置反應體系