豬源大腸桿菌的血清型鑒定及耐藥性監測研究眾所周知，我國長期以來一直是世界上出名的豬肉生產和消費國家，因此我國的肉豬養殖市場不斷地發生增長。從以前的散養戶到當前的大規模集中化養殖。然而由于集中規模養豬的發展，養殖的時候或多或少會出現養豬疾病，這樣豬就無法得到健康的成長，在所有的疾病當中，豬源大腸桿菌疾病是養豬場內最為常見的，其病情表現得多樣化和復雜。使得生產性能下落，經濟效益無法增長，然而養豬成本不斷攀升，使得很多養豬專業戶遭受大量的損失。并且為預防和治療細菌性疾病，抗生素被廣泛應用，一些抗生素還被用作動物養殖中的促生長發育飼料添加劑，不正當的使用導致動物體內菌株對抗菌藥物的抗性快速上升。一方面大腸桿菌血清型種類眾多，難以確定抗原的血清型，造成疫苗免疫的針對性差和有效保護不足;另一方面多重耐藥菌株的產生又使藥物療效大打折扣導致臨床不能有效防治。為了解本地區豬場大腸桿菌血清型及菌株耐藥情況，本研究對周邊20個中小規模養豬場和屠宰場進行病料采集和大腸桿菌分離鑒定，并進行藥敏試驗和血清型鑒定，為本地豬場大腸桿菌病防治提供理論依據。關鍵詞：豬源大腸桿菌；血清型鑒定；耐藥菌株目錄TOC\o"1-4"\h\u87391前言 184911.1研究背景 1177691.2研究目的意義和主要內容 1236452豬源大腸桿菌概述 154802.1豬源大腸桿菌概述 155702.2豬源大腸桿菌病的流行病學 2252722.3大腸桿菌抗原特性 2246982.4抗生素防治研究進展 233833豬源大腸桿菌血清型鑒定 3228233.1目的與意義 3292683.2材料 355063.2.1豬血清樣品及病料 3283573.2.2培養基 3117223.2.3材料設備 458233.3鑒定方法與結果 557673.3.1細菌培養 584933.3.2鑒定方法 5300603.3.3血清鑒定結果 696053.4討論 6129084豬源大腸桿菌耐藥性檢測 623244.1研究的目的與意義 6200184.2材料 782014.3鑒定方法與結果 745104.3.1藥敏試驗 7265044.3.2致病菌大腸桿菌分離鑒定結果 715294.3.3耐藥性測定結果 7106274.4討論 8255995豬源大腸桿菌滅活疫苗的制備及免疫保護效力評價 882385.1目的與意義 8225065.2試驗方法及材料 877545.2.1材料 8110435.2.2方法 8109095.3結果分析 9103185.3.1滅活苗的研制 9123675.3.2滅活苗的檢驗 9298875.3.3免疫保護試驗 9130615.4討論 9129636結論 911498參考文獻 111前言1.1研究背景隨著生豬產業的發展，豬源大腸桿菌疾病風險也不斷加大，豬源大腸桿菌疾病傳播不斷加快，豬源大腸桿菌疾病致死率不斷上升。豬源大腸桿菌疾病已成為威脅生豬產業健康發展、食品質量安全、公共衛生乃至國家經濟社會發展的重大問題。豬源大腸桿菌疾病主要有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，仔豬黃痢、仔豬白痢是危害現在豬養殖業重要傳染病之一，它具有較高的發病率和死亡率，主要危害1-7d的仔豬，但是感染腸致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)是仔豬黃痢、仔豬白痢的主要原因。仔豬黃白痢又稱早發性大腸桿菌病，由致病性大腸桿菌引起，一種主要發生于1-7d仔豬急性、致死性傳染病，該病有高的發病率(90%-95%)和死亡率（30%），尤其是首胎母豬，發病率可達85%以上，其臨床表現為腹瀉、排除黃色水樣糞便和迅速死亡[1]。環境因素、母豬體質和營養水平常常影響仔豬腸道微生物穩態是誘發仔豬黃痢的重要原因，帶菌母豬和患病仔豬是仔豬黃痢主要傳染源，通常通過污染母豬皮膚、乳頭和環境，因此初生仔豬吸吮乳頭、接觸母豬皮膚及被感染的食物飲水時，病原就可以通過仔豬消化道從而導致仔豬黃痢的發生，因此，該疾病顯著影響仔豬存活率和斷奶重，嚴重制約生豬養殖業的健康發展。豬源大腸桿菌疾病儼然已成為制約生豬產業發展的關鍵因素，極大的影響著生豬安全生產以及人類健康，因此做好豬源大腸桿菌疾病的防控成為世界各國發展生豬產業，穩定生豬市場與社會經濟秩序的重要課題。鑒于此原因，本課題于本地區的養豬場的仔豬進行取樣，取樣前對仔豬的體況進行檢查，采樣后封存于無菌試管中，隨即送到實驗室進行豬源大腸桿菌疾病病原分離鑒定，明確豬源大腸桿菌疾病的發病情況，為豬源大腸桿菌疾病的治療和預防提供有用的理論依據。1.2研究目的意義和主要內容基于致病性大腸桿菌是導致仔豬黃痢、仔豬白痢的重要原因，本文主要對豬源大腸桿菌的血清型鑒定及耐藥性監測進行研究，旨在了解豬源大腸桿菌疾病的感染狀況，確定本地區的豬源大腸桿菌疾病主要病原及其分布特點，為制定科學合理的防治對策提供科學依據；同時針對目前豬源大腸桿菌疾病發生和流行特點，制定出系統的保健計劃，確保養豬業健康、持續、快速地發展。為了避免仔豬黃白痢的進一步蔓延，及時采取有效的防控措施，確保仔豬不受病害的危害，使仔豬健康生長，避免豬場的嚴重經濟損失，為地區防治該病提供理論依據和技術指導。2豬源大腸桿菌概述2.1豬源大腸桿菌概述大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)俗稱大腸桿菌，屬于埃希菌屬，菌體周生菌毛和鞭毛，部分菌株有微夾膜，大多數菌株有運動性。菌株經革蘭染色后以油鏡觀察，視野中可見粉紅色短桿菌，大小約為0.4μm~0.7μm×2μm~3μm，是兼性厭氧菌，能在多種培養基中生長，菌落在普通營養瓊脂平板上生長為灰白色，在伊紅美蘭瓊脂平板上生在為藍紫色且具有金屬光澤，在麥康凱瓊脂平板上生長為粉紅色，可通過菌落在不同培養基上形態進行鑒別和純化。非致病大腸桿菌是腸道正常菌群的組成部分，而致病性大腸桿菌可引起動物發生腹瀉、敗血癥和衰竭等癥狀，嚴重時甚至會導致動物死亡[2]。2.2豬源大腸桿菌病的流行病學豬大腸桿菌一般為仔豬黃白痢，仔豬黃白痢的致病原因是由大腸桿菌而引起的一種多發性傳染病。仔豬黃白痢，又稱仔豬大腸桿菌病，這種傳染病致死率比較高，發病表現為腹瀉、排黃白色或黃色水樣排泄物和快速脫水。1周或者1-3天的仔豬是最常見的。仔豬在同一窩中的發病率很高，通常在90%以上，死亡率很高，有時甚至整窩都出現死亡的情況。仔豬白色痢疾又稱延遲性大腸桿菌病。臨床表現為腹瀉、排白乳、黃白色或灰白色痰粘液便。仔豬黃白痢是世界范圍內的一種普通病和多發病，其特點是發病范圍廣，發病率較高，耐藥性強和治愈率低[3],大腸桿菌則是引起仔豬黃白痢最重要的病因之一,隨著現代化養殖業的不斷發展，雖然各種醫療條件和養殖業的養殖環境都在不斷提升，但是國內各個地區的仔豬黃白痢的發病率依然沒有明顯下降，隨之而來的是高質量豬肉的減少,如何降低仔豬黃白痢的發病率對生豬養殖業造成的巨大的危害，如何降低仔豬黃白痢的發病率是當前亟待解決的一個關鍵環節[4]。近年來，該病嚴重危害了我國養豬業。2004年7月至2005年7月，石愛華對遼寧省錦州市34個鄉鎮65名農民80頭母豬生產的809頭仔豬進行了調查[5]。結果表明，該病發生在全鎮調查。平均發病率和死亡率分別為20.3%和27.5%，給當地養豬業造成了巨大的經濟損失。申胤生等人報道，2006年2月至4月，陜西省某大型養豬場16窩仔豬在出生后2-3天死于大量疾病。最后的診斷是由小豬體內的大腸桿菌引起的[6]。據文獻記載，該病主要導致1～30日齡仔豬感染黃、白糞便并迅速死亡。發病率為90%-95%。頭發病的發病率在30-60%之間。死亡率一般在30%左右，其中一些超過80%[7]。它是影響大型養豬場和農村散養仔豬成活率的一種重要疾病。因此，對該病的研究對整個養豬業的健康發展，提高農民的經濟水平，促進整個國民經濟的健康有序發展具有重要意義。2.3大腸桿菌抗原特性大腸桿菌抗原主要有菌體抗原(O),鞭毛抗原(H)及勃附素抗原和莢膜抗原(K)，大腸桿菌一共有抗原有173種，K抗原有80種，H抗原有56種，不同動物對大腸桿菌的血清型敏感性不同，豬主要對O8、09、0139等13中血清型敏感，并且由于不同地區或者不同養殖場的管理不同，導致在不同地區或者不同養殖場流行的O抗原的血清型有所不同，大腸桿菌的K抗原屬于勃附素，與仔豬腹瀉密切相關的K抗原包括F4、F5、F6、F41四種，而大腸桿菌的H抗原與仔豬腹瀉關系較小。2.4抗生素防治研究進展抗生素療法是目前針對致病性大腸桿菌的常規療法，常與補液療法聯合使用。目前，我國在臨床上普遍使用的抗生素包括β內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、喹諾酮類。抗菌藥物的不斷應用導致大腸桿菌耐藥菌株不斷增加，致使治療效果愈發不理想。臨床上經常使用的廣譜高效抗生素類藥物在抑殺病菌的同時，也會對動物胃腸中正常有益微生物菌群造成損害，致使動物機能紊亂。所以在使用抗生素治療大腸桿菌時，首先應進行藥敏試驗，根據藥敏實驗結果選用針對性較強的抗生素，并根據患病動物反應及時調整用藥方案。隨著抗生素的使用，細菌耐藥性越來越高。楊莉，余波等為了解貴州省豬源大腸桿菌對抗生素耐藥的情況，采集2018—2019年貴州省5個市縣規模豬場的糞便和樣品1202份,經分離培養和生化鑒定,獲得大腸桿菌532株,藥敏試驗結果顯示大部分大腸桿菌分離株對抗生素多重耐藥,這對指導貴州大腸桿菌病防治具有重要的臨床意義。每個地區飼養模式、疾病防控、管理水平等差異導致大腸桿菌的耐藥存在明顯的地域差性和耐藥情況越來越嚴重，因此有必要進行尋找新型的防治藥物和技術手段。3豬源大腸桿菌血清型鑒定3.1目的與意義豬大腸桿菌疾病是養豬場最為常見和造成經濟損失比較嚴重的一種腸道疾病，豬大腸桿菌疾病一般為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，造成嚴重的經濟損失。國內外對豬大腸桿菌疾病作了大量研究，但是豬大腸桿菌疾病的發生受到仔豬生活環境、自身的免疫力和飼養管理條件的影響，在不同的區域發病率有所不同，豬大腸桿菌疾病的發生大多數是由病原微生物引起的。為了掌握本地區豬場大腸桿菌血清型分布和耐藥情況，2020年5月至2021年1月，對本地區20個中小規模養豬場和屠宰場進行病料采集和大腸桿菌分離鑒定，并進行血清型鑒定，為本地豬場大腸桿菌病防治提供理論支持。3.2材料3.2.1豬血清樣品及病料采自本地區20個中小規模養豬場，共計200份，均為仔豬。這20個規模化豬場（編號：A1-A20）飼養規模在300頭母豬群到800頭母豬群之間，均為一條龍式生產，飼養品種為杜洛克-長白-大白；PRRS，PCVII，MH以及APP均沒有免疫；PR的免疫程序為種豬3-4次年，生長育肥豬在65-70日齡免疫一次，使用的疫苗為進口gF一缺失弱毒活疫苗；CSF免疫程序為種豬2次/年，仔豬在25和65日齡免疫2次，使用兔化弱毒細胞苗。3.2.2培養基表3-1培養基、試劑、儀器及生產廠家培養基及試劑名稱生產廠家普通肉湯培養基廣東環凱微生物科技有限公司科技有限公司瓊脂肉湯培養基上海生工生物工程技術服務有限公司鮮血瓊脂平板購自寶生物工程(大連)有限公司河南比根生物科技有限公司4SGreen核酸染料上海生工生物工程技術服務有限公司胰蛋白胨大豆瓊脂青島海博生物技術有限公司葡萄糖杭州天和微生物試劑有限公司甘露醇杭州天和微生物試劑有限公司微量生化發酵管杭州天和微生物試劑有限公司麥康凱瓊脂培養基上海市醫學化驗科技有限公司西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂北京奧博星生物技術有限公司伊紅美藍瓊脂培養基（EMB）北京奧博星生物技術有限公司馬鈴薯葡萄糖瓊脂青島高科園海博生物技術有限公司厭氧菌瓊脂青島高科園海博生物技術有限公司三糖鐵瓊脂培養基（TSI）北京奧博星生物技術有限公司甘露醇發酵青島高科園海博生物有限公司5%綿羊血瓊脂平板青島高科園海博生物有限公司血液瓊脂基礎培養基青島高科園海博生物技術有限公司磷酸鹽緩沖稀釋液青島高科園海博生物技術有限公司抗生素藥敏片上海士鋒生物科技有限公司MH肉湯青島高科園海博生物技術有限公司革蘭氏陽性菌鑒定板河南牧業經濟學院實驗中心提供革蘭氏陰性菌鑒定板（GNID）河南牧業經濟學院實驗中心提供普通肉湯培養基制作：稱取牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、NaCl5g、K2HPO41g、蒸餾水1000ml，將上述物質混合搖勻后加熱溶解，以0.1mol/LNaOH溶液調整酸堿度至pH7.4～7.6，用濾紙過濾后分裝，置高壓鍋內121℃滅菌15～30min備用。7.5%NaCl營養肉湯培養基制作：在普通肉湯培養基制作的基礎上，將肉湯中NaCl含量增加，配制為7.5%NaCl營養培養基。普通瓊脂培養基制作：將瓊脂按500ml肉湯內加10g的比例加熱煮沸，瓊脂完全溶化后調pH至7.4～7.6，再加熱20min，用紗布夾脫脂棉過濾、高壓滅菌制成斜面或平皿待用。5%鮮血瓊脂培養基：將滅菌后的普通瓊脂培養基加熱融化，降溫至50℃左右，加入5%無菌脫纖綿羊或家兔鮮血，混合均勻后，分裝入滅菌試管或平皿。待凝固后，置37℃培養24h，檢驗無菌后即可使用。3.2.3材料設備試驗過程中所用試驗儀器和試劑耗材見表3-2所示。表3-2試驗儀器和試劑耗材儀器名稱Apparatus型號Model購買廠家或地址CompanyorAddtess無菌操作臺HD-850上海勝衛電子科技有限公司臺式高速離心機H2-16KR上海盧湘儀離心機儀器有限公司Eppendorf移液器系列1000μL,200μL,100μL,20μL10μL,2.5μL德國臺式溫床振蕩器IS-RSD3蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司PCR儀SelectCyclerII上海巴玖電子天平FA系列上海丙林電子科技有限公司凝膠成像儀KodakDC120美國超低溫冰箱DW-86L338海爾三恒電泳儀EPC3000上海超凈工作臺CJ-2D天津泰斯特電熱恒溫水浴鍋21-6江蘇常熟冰箱BCD-257SL美的紫外分光光度計CintraGBC公司全溫振蕩培養箱TS-2102GZ常州高德儀器制造有限公智能水浴恒溫振蕩器ZYS-300A黑龍江東拓儀器制造有限公司超低溫冷凍儲存器DW-HL3958中科美菱低溫科技股份有限公司奧林巴斯顯微鏡CKX53日本立式壓力蒸氣滅菌器LDZH-200KBS上海申安分析天平BA600－4麥克奧迪實業有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱DHG－9033B5上海新苗醫療器械電熱恒溫培養箱LDZM中科美菱低溫科技股份有限公司3.3鑒定方法與結果3.3.1細菌培養在病原菌分離培養前，先將樣本充分混合均勻，嚴格無菌操作，將樣本分別接種于普通瓊脂斜面、普通肉湯和5%鮮血瓊脂斜面，置37℃恒溫箱進行培養增殖24h，觀察培養物生長情況和菌落形態特征，并進行記錄。對菌落進行涂片，革蘭氏染色后鏡檢，根據培養物鏡檢結果，選擇特征性菌落接種血瓊脂和普通瓊脂、普通肉湯培養基、麥康凱瓊脂平板培養基，置恒溫箱72h重新培養，用于細菌鑒定和PCR分子鑒定。3.3.2鑒定方法3.3.2.1病原菌培養和鏡檢鑒定培養到一定時間后，觀察培養基上有沒有菌落生長，如果有，再進行觀察細菌生長的菌落形態、大小、規則度、顏色等。鏈球菌在普通瓊脂培養基上生長不良或不生長，在5%鮮血瓊脂上生長為細小光滑、扁平或突起、邊緣整齊白色菌落，進行記錄。肉湯接種培養后，觀察肉湯透明度、渾濁程度、是否管底有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附著物，是否出現菌臘膜、菌環等。在肉湯中除乳房鏈球菌使肉湯一致混濁外，無乳、停乳鏈球菌在管底形成絮狀沉淀。腸桿菌在肉湯中呈均勻混濁，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌環。然后進行記錄。除此之外，對于培養的細菌進行涂片染色鏡檢，初步來鑒別細菌類別，顯微鏡下來觀察細菌形態特征，根據病原菌大小、形態、有無莢膜、芽孢等特征進行細菌初步鑒定。3.3.2.2病原菌的生化鑒定把純化培養基的病原菌分別進行IMViC試驗，包括吲哚、甲基紅(MR)、VP及枸櫞酸鹽利用等試驗，進一步進行三糖鐵斜面培養，觀察試驗結果并拍照記錄，目的是用于確定純化培養基中的細菌是否為大腸桿菌，觀察并記錄結果。表3-3大腸桿菌和克雷伯氏菌培養基生長特征名稱生長特征血液瓊脂基礎培養基麥康凱瓊脂培養基大腸桿菌菌落生長較好，灰黃色，表面光滑濕潤，有時出現β-溶血現象。生長較好，粉紅色不透明，放置后菌落顏色開始由紅變白。克雷伯氏菌菌落生長旺盛，色黃，表面呈隆起，光滑濕潤。生長特別旺盛，2-3mm，高度隆起，粉紅色不透明，放置后菌落轉白。表3-4大腸桿菌的生化鑒定指標菌名三糖鐵脲酶枸櫞酸鹽MR葡萄糖甘露醇吲哚VP乳糖阿拉伯糖大腸桿菌克雷伯氏菌–––––+++±+++–±±–++++將鑒定后的菌株接種于營養瓊脂斜面培養基37℃過夜培養，用0.5%石碳酸生理鹽水2mL沖洗細菌菌落，收集密封在5mL玻璃瓶內并用生理鹽水稀釋至1×1010CFU/mL，121℃高壓滅菌2h，作為待檢抗原備用。移液槍吸取O抗原單因子血清1滴到玻片上，再取1滴待檢抗原加入血清，立即混勻，靜置5min后觀察結果，如果出現凝集則為陽性。以待測抗原和生理鹽水混合液作為空白對照，排除細菌自凝現象。3.3.3血清鑒定結果所有420份血清樣本檢測總結果顯示，PRV的陽性率為6.2%（26/420）。各豬場及各生長階段豬群檢測結果如下：43株分離菌中的35株分屬6種血清型，優勢血清型為O149、O20、O141、O8、O137、O87,血清型的菌株占已鑒定菌株的94%。另有6株未能定型，占分離菌株的18.6%,詳見表3-5。表3-5樣本檢測血清型情況血清型O149O20O141O8O137O87菌株數864351來源豬場數6421313.4討論對43份大腸桿菌進行血清定型實驗，共有6種。而且本地區內各個豬場之間亦有所不同，同一豬場可存在多個血清型。且血清型十分復雜，這與豬場不斷從外地引進種豬更新豬群，以及這些菌株的變異性和更迭性等有密切關系。而且，各豬場不同時期流行的血清型也不盡相同。因此，在防治本病時應充分注意，必須定期對豬場的大腸桿菌進行分離鑒定，選擇疫苗時應與本地流行血清型相對應，選用針對性較強的菌株制苗進行免疫，有條件的豬場應進行血清型的診斷或采用本地(場)菌株制造滅活疫苗進行預防接種。4豬源大腸桿菌耐藥性檢測4.1研究的目的與意義大腸桿菌容易接受其他細菌的耐藥基因或在抗生素壓力下產生耐藥性，可通過多種遺傳因素將耐藥基因轉移到敏感菌株，從而導致細菌耐藥性的傳播，提高細菌耐藥性會導致細菌性動物疾病不能用常用藥物治愈，而被迫增加抗生素的劑量或使用更多的抗生素，進一步促進耐藥性的增長，從而造成惡性循環。4.2材料病料來自于本地區4個區縣共計420份樣本，送往實驗室進行病原微生物的分離鑒定和分子鑒定（PCR法）。試驗過程中所用試驗儀器和試劑耗材見表3-1、3-2所示。4.3鑒定方法與結果4.3.1藥敏試驗在分離培養細菌的培養皿中，加入1ml生理鹽水，用無菌接種環刮取培養基表面菌落，使之盡可能多地進入生理鹽水中。取硫酸鋇標準比濁管，與菌液比濁，用生理鹽水稀釋菌液到標準濁度。用1ml滅菌吸管吸取細菌懸液，在90mm平皿培養基內加入約0.4ml，用涂菌棒涂勻。靜置5min，待菌懸液稍干后，沿平皿邊緣（距皿壁約1cm）均勻貼上藥敏紙片。每個平皿內貼5個，將平皿倒置于37℃恒溫培養箱內培養10h后取出，用卡尺測量每個藥敏片的抑菌范圍即抑菌圈直徑，并記錄。根據美國臨床和實驗室標準協會抗菌藥物敏感試驗標準M100來判斷致病菌對各種抗生素的耐藥程度，抑菌范圍d≥20mm以上為高度敏感，15mm＜d＜19mm范圍為中間；d≤14mm為耐藥。4.3.2致病菌大腸桿菌分離鑒定結果致病菌大腸桿菌分離鑒定共計420份樣本進行細菌分離鑒定，病料接種麥康凱平板，在71份樣本中分離到48株菌落呈圓形、中等大小的磚紅色疑似大腸桿菌的菌株。將48株紅色菌落中的細菌分別進行生化試驗，有3株產H2S(YJX3，CYQ9，FMQ6)，1株VP試驗和構椽酸鹽利用試驗為陽性(PSS9)，1株MR試驗和JIA試驗為陰性，予以剔除，其它菌株均能發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇產酸。各菌株均不產生HzS。根據伯杰氏細菌鑒定手冊，鑒定出大腸桿菌43株。4.3.3耐藥性測定結果結果表明，所分離到的大腸桿菌對硫酸鏈霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、先鋒靈針劑、乳酸諾氟沙星和復方新諾明比較敏感，但對壯觀霉素和磺胺嘧啶鈉都產生耐藥性，不同的致病菌對不同的藥物敏感度有所不同。表4-1致病菌耐藥試驗結果抗生素名稱藥敏片含量（μg/片）大腸桿菌阿米卡星30S硫酸鏈霉素10I頭孢噻肟30S恩諾沙星5R氧氟沙星5S林可霉素2I慶大霉素10I壯觀霉素10R硫酸卡那霉素30S磺胺嘧啶鈉250R先鋒靈針劑30S四環素30R鹽酸環丙沙星5S乳酸諾氟沙星2I克林霉素2I鹽酸土霉素30R復方新諾明100S頭孢曲松30S注：S代表敏感（抑菌環在?20mm），I代表中介（抑菌環15mm＜d＜19mm），R代表耐藥（抑菌環d＜14mm）4.4討論在藥敏耐藥性試驗中可知，不同的地區和不同規模的養豬場分離出的細菌對抗生素產生不同程度的耐藥性，有的抗生素敏感度很高，這可能是由于本試驗調查的養豬場條件不同，治療方面所用抗生素種類也有所不同，所以，分離出的致病菌中都有不同程度的耐藥性，試驗結果與國內有關報道基本吻合。5豬源大腸桿菌滅活疫苗的制備及免疫保護效力評價5.1目的與意義盡管抗生素對仔豬黃痢具有較好的防治效果，但是隨著抗生素的濫用導致大腸桿菌具有較高的耐藥性；因此針對當地優勢大腸桿菌血清型自制相應的滅活苗進行產期母豬免疫可有效預防仔豬黃痢的發生，從而保證仔豬的健康生長。5.2試驗方法及材料5.2.1材料試驗菌株、麥康凱瓊脂培養基、普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基、福爾馬林、妊娠母豬杜洛克(由本地區某養豬場提)。5.2.2方法5.2.2.1滅活苗的研制將血清型菌株接種于營養瓊脂平板上，在37℃生化培養箱中培養18～24h，再用無菌生理鹽水輕輕沖洗。將洗滌后的培養物收集并包裝在滅菌瓶中。用Macintosh比濁法測定各血清型菌株的細菌數。根據細菌數量，加入不同量的無菌正常鹽水，使其含有細菌總數，然后在細菌稀釋液中加入體積為0.4%的福爾馬林，輕輕搖動，于37℃條件下滅活，48h后包裝密封。5.2.2.2滅活苗的檢驗取適量的滅活苗，采用妊娠母豬安全性進行檢查：選擇10頭產前15d左右的妊娠母豬，皮下注射4ml滅活苗，試驗期為一周，觀察妊娠母豬的采食、生長狀態、流產情況及產后新生仔豬的生長情況等。5.2.2.3免疫保護試驗滅活苗對妊娠母豬免疫保護的影響選擇10頭產前15d左右的妊娠母豬，皮下注射2ml的滅活苗，待妊娠母豬產子后，選擇10頭體重相近的仔豬，采用滅活前的混合細菌懸液(2ml)對相應的仔豬進行攻毒，試驗期為一周，觀察仔豬斷奶期內的生長情況，并記錄仔豬發生黃痢的頭數和死亡情況，測定其對仔豬的保護率。5.3結果分析5.3.1滅活苗的研制將滅活苗接種于普通瓊脂或麥康凱瓊脂平板上后通過顯微鏡觀察發現培養基上無任何微生物生長。5.3.2滅活苗的檢驗采用妊娠母豬對滅活苗的安全性進行檢查發現，在注射一周后，妊娠母豬無異常反應，健康狀況良好，采食正常，無流產等現象，滅活苗注射未對母豬、胎兒及新生仔豬無負面影響。5.3.3免疫保護試驗采用滅活苗進行免疫后，使仔豬黃白痢的發生率降至10.98%，單因素方差分析結果表明滅活苗對仔豬黃白痢有顯著的的預防效果。5.4討論豬大腸桿菌優勢血清型制備滅活疫苗，該滅活苗對母豬、胎兒及新生仔豬沒有負面影響；并且能顯著降低豬大腸桿菌病的發病率和死亡率，滅活苗免疫對仔豬具有顯著的保護作用。6結論本文對本地區養豬場進行調查，從細菌分離鑒定試驗中，我們可以得出在71份樣本中分離到48株菌落呈圓形、中等大小的磚紅色疑似大腸桿菌的菌株。從各豬場血清檢測結果來看，所有420份血清樣本檢測總結果顯示，PRV的陽性率為6.2%（26/420）。各豬場及各生長階段豬群檢測結果如下：43株分離菌中的35株分屬6種血清型，優勢血清型為O149、O20、O141、O8、O137、O87,血清型的菌株占已鑒定菌株的94%。另有6株未能定型，占分離菌株的18.6%。并且420份樣本進行耐藥性試驗表明，不同的菌株對抗生素均有一定的耐藥性。基于以上內容的分析，得出早期斷奶仔豬腹瀉的原因很多，也是現階段早期斷奶仔豬常見的問題。如未能加以有效的防治，則可能使仔豬走向死亡，并且給養殖戶帶來一定的經濟損失。對于仔豬黃白痢病的防治，本文提出以下幾點建議:一是合理設置生產用房，做好生產用房消毒工作，及時清理生產用房，保證生產用房的清潔衛生。建立健全豬場生物安全體系，以衛生清潔消毒為中心，將消毒衛生工作貫穿于豬場生產的各個環節。其次，加強母豬的產期管理，增強母豬的抗病能力，預防疾病的發生。斷奶后仔豬免疫力增強，飼料粗蛋白水平逐漸提高。參考文獻BelaN,PeterZF.2005.EnterotoxigenicEscherichiacoliinveterinarymedicine.InternationalJournalofMedicalMicrobiology,295:443~454.單玉平,朱國強,李鋒,等.連云港市規模