DNA的復制

DNAReplication

講授：陳友生物科學與技術學院2014/3/24第四章DNA的復制2第四章DNA的復制2生命的遺傳實際上染色體DNA自我復制的結果，染色體DNA的自我復制主要通過半保留復制來實現的，是一個以親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過程。?親代DNA必須以自身分子為模板來合成新的分子，準確地復制成兩個拷貝，并分配到兩個子代細胞中去，才能真正完成其遺傳信息載體的使命。第四章DNA的復制2教學重點

DNA復制的相關概念，特點。參與復制的主要物質及其作用教學難點

DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ結構與功能DNA復制的起始、延伸和終止（以E.coli為例）第四章DNA的復制2問題：

1、復制可以隨機起始嗎？

2、復制是單向的還是雙向的？3、新生鏈合成的方向是從5’to3’

還是3’to5’，還是兩個方向均可？

4、復制時兩條鏈是完全解開嗎？

5、兩條鏈是同時進行復制的嗎？第四章DNA的復制2是指以親代DNA為模板合成子代DNA的過程。即遺傳物質的傳代。復制親代DNA子代DNA復制(replication)

一、DNA復制的一些概念第四章DNA的復制2復制子（replicon）復制子是基因組中能夠獨立進行復制的單位。每個復制子都有控制復制開始的復制起點（origin）以及終止復制的終點（terminus）。任何起點和終點之間的序列都作為復制子的一部分參與復制。在一個細胞周期中，每個復制子只啟動一次。復制起點：復制子有控制啟動復制的元件，稱為復制起點(originofreplication)，常用ori來表示；可以起始一個復制循環，并可控制復制起始反應的頻率。復制終點：控制終止復制的元件，稱為復制終點(termini);第四章DNA的復制2復制叉（replicationfork）：DNA復制時在DNA鏈上通過解旋、解鏈和SSB蛋白的結合等過程形成的Y字型結構稱為復制叉或生長點（growingpoint）。在復制叉處作為模板的雙鏈DNA解旋，同時合成新的DNA鏈。DNA復制首先將雙螺旋DNA解旋，這一過程需要特異的拓撲異構酶或解旋酶；DNA的復制至少需要20多種酶和蛋白質結合在復制叉部位，形成復雜的復制體結構。第四章DNA的復制2半保留復制在復制過程中首先兩條親本鏈之間的氫鍵斷裂,雙鏈分開，然后以每條親本鏈（parentalstrand）為模板，按堿基互補配對原則(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互補子鏈（daughterstrand）。復制結束后，每個子代DNA的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的,并且，新形成的兩個DNA分子與原來的DNA分子的堿基序列完全相同。這種復制方式稱為半保留復制(semiconservationreplication)。1958年Meselson和Stabl用實驗證明了DNA復制是半保留式的。第四章DNA的復制2AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復制過程中形成的復制叉子代DNA

半保留復制第四章DNA的復制2第四章DNA的復制2半不連續復制由于DNA雙螺旋的兩條是反向平行的，因此在復制叉附近解開的DNA鏈一條是5’-3’方向，另一條是3’-5’方向.DNA聚合酶活性是使DNA鏈沿5’-3’方向延申，所以就決定了前導鏈的復制是連續的，而滯后鏈的復制是不連續的。因此稱為DNA的半不連續復制。第四章DNA的復制21、前導鏈（leadingstrand）

以5￠-3￠方向連續合成的DNA鏈2、滯后鏈（laggingstrand）

總體上沿著3￠到5￠方向延伸，但以小片段形式(5￠-3￠)不連續合成，最后共價連接起來3、岡崎片段（Okazakifragment）在非連續復制中產生的短片段，隨后被連接成完整的鏈

E.coli1000-2000nt

真核生物100-200nt第四章DNA的復制2解鏈方向半不連續性復制（復制叉）3

5

3

5

3′5′3′5′3′5′

領頭鏈、前導鏈(leadingstrand)隨從鏈、滯后鏈

(laggingstrand)岡崎片段（Okazakifragment）第四章DNA的復制2二、復制方向1、相向復制（腺病毒）2、單向復制（質粒ColE1DNA3、雙向復制第四章DNA的復制2DNA復制的幾種主要方式原核生物的染色體和質粒噬菌體λ復制后期、φX174、T4等噬菌體以及爪蟾卵母細胞的rRNA基因等。線粒體；葉綠體也采取此種方式，但雙鏈環兩條鏈的起點不在同一位置。第四章DNA的復制2三、復制速度真核生物復制叉移動速度為1~3kb/min，細菌DNA復制叉的移動速度為50kb/min，相差20~50倍；真核生物染色體在全部復制完成之前起點不再重新開始復制，而在快速生長的原核生物中，起點可以連續發動復制。第四章DNA的復制2

1）引物(primer)：復制需要一小段RNA作引物2）模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈3）底物(substrate)或稱原料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP4）能源：需ATP供能，原料dNTP本身也是高能化合物5）酶和蛋白質因子：DNA聚合酶(polymerase)等四、參與DNA復制的物質及作用第四章DNA的復制2RNA引物（RNAprimer）

與一條DNA鏈配對的短序列(通常是RNA)，（1）RNA引物可以提供3’-OH末端作合成新DNA鏈起點；（2）提高了DNA復制的準確性。因為DNA復制開始時摻入的核苷酸往往容易出錯，加在RNA引物中可以被切除，不會影響DNA復制的準確性。

問題：為什么需要有RNA引物來引發DNA復制呢?第四章DNA的復制2參與DNA復制的蛋白質1.DNA解旋酶（DNAhelicase）作用：解開雙鏈2.單鏈結合蛋白（singlestrandbindingprotein,ssb）作用：防止單鏈退火（在原核細胞中表現出協同效應）第四章DNA的復制23.引發酶（primase）

DnaG(E.coli)

引發體Primosome4.DNA連接酶（DNAligase）需要能量

NAD（E.coli）/ATP（真核）5.DNA螺旋酶（DNAgyrase）----拓撲異構酶Ⅱ

斷裂雙鏈引入負超螺旋（swivelfunction)

需要ATP第四章DNA的復制26.DNA聚合酶（DNApolymerase,Pol）

ThreeDNAPolymerases（E.coli）（1）PolI DNA聚合酶

3′5′核酸外切酶（校對）

5′3′核酸外切酶（損傷修復、去除引物）缺口填充（大缺口）

DNA損傷修復缺刻平移Nicktranslation（去除引物）（2）PolII

活性很低，不是DNA復制必需的，主要起修復的作用（3）PolIII3′5′核酸外切酶（校對）ε亞基

DNA聚合酶（必需）α亞基（dnaE）缺口填充（小于100bp）（4）.PolⅣ和Ⅴ是1999年發現，它們能在DNA損傷部位繼續復制第四章DNA的復制2討論：

1、PolIandIII功能上有哪些相同點？

2、

PolIandPolIII功能上有哪些不同？第四章DNA的復制2

[1]以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為底物催化合成DNA[2]需要模板(3′5′)和引物的存在

[3]不能從頭合成新的DNA鏈（必須有3’-OH末端）

[4]催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3’-OH末端

[5]催化DNA合成的方向是5’→3’[6]有3′5′核酸外切酶活性（校對功能）1、PolIandPolIII相同的功能特點：第四章DNA的復制2

[1]5’→3’核酸外切酶活性不同。

[2]PolI可進行缺刻平移、去除引物。

[3]二者聚合酶活性不同，PolIII是大腸桿菌

DNA復制中鏈延長反應的主導聚合酶。

[4]PolI主要功能是進行DNA損傷修復。2、PolIandPolIII不同的功能特點：第四章DNA的復制2CompositionofE.coliDNAPolymeraseIIIHoloenzymeSubunit Function Subassembliesα DNApolymeraseε 3-to5-exonuclease Coreθ Stimulatesεexonuclease PolIII’τ Dimerizescore Bindsγcomplexγ BindsATPδ Bindstoβ PolIIIδ’ Bindstoγandδ γcomplexχ BindstoSSB (DNA-dependentATPase)ψ Bindstoχandγβ SlidingclampDNA聚合酶III第四章DNA的復制21、β亞基（1）結構：環狀的二聚體（2）作用：“活動夾板”允許全酶沿著DNA滑動使全酶的持續性很高第四章DNA的復制22、DNA聚合酶III----形成不對稱的二聚體

使前導鏈、滯后鏈的合成可同時進行提高酶持續合成能力3'-5'外切酶校對功能核心酶二聚化組建核心酶5'-3'合成DNA的催化活性夾子裝配器，協同β亞基嵌住模板DNA第四章DNA的復制2滯后鏈模板形成了一個回環，使環中RNA引物和岡崎片段的合成方向與前導鏈一致，以適應雙鏈在同一復制體上進行復制3、回環模型第四章DNA的復制2“θ”型復制環狀DNA的復制方式，即從復制起點開始，雙向同時進行，形成θ樣中間物環節：

DNA復制的起始

DNA鏈的延伸

DNA復制的終止

第二節細菌DNA復制第四章DNA的復制2一、細菌DNA復制起始（一）復制起始復合體

DnaA（起始點結合蛋白)DnaB（解旋酶）

SSBDnaC（裝載解旋酶和引發酶）

HU（識別并刺激OriC

形成開鏈）

Gyrase（促旋酶）---拓撲異構酶Ⅱ第四章DNA的復制2（二）復制起始區的結構特點

1、富含AT2、3個13bp的重復序列---解鏈的位點

3、4個9bp的重復序列-----DnaA結合位點第四章DNA的復制2（三）復制起始引發的過程：

1、DNA復制起點雙鏈解開

，形成復制叉GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA+ATPDnaBDnaCOriC（富含AT）3×13bp重復序列4×9bp重復序列

DnaA結合位點HU+ATPATP第四章DNA的復制2過程：（1）約20個DnaA結合在4×9bp重復序列（2）DnaA復制起始復合物使13bp重復序列變性，形成開鏈（3）DnaB與單鏈DNA結合（需要DnaC幫助），進一步解開DNA雙鏈，形成復制叉第四章DNA的復制22、RNA引物的合成

leadingstrand:primase（引發酶）

laggingstrand:primosome引發體（引發前體＋primase）引發前體：n蛋白、n’蛋白、n”蛋白、i蛋白、

dnaB蛋白和dnaC蛋白

3、DNA聚合酶將第一個dNTP加到引物的3'-OH末端

第四章DNA的復制2θεSSBDnaGprimaseDnaBhelicasePolIII

（/）引發體（primosome）PolI、ligase復制體（replisome）

invivo

二、細菌DNA復制延伸第四章DNA的復制2（二）DNA聚合反應的特征1、DNA的聚合反應是以dNTP為底物，以3’→5’

DNA為模板，按堿基配對原則在3’-OH上加dNTP

（DNA聚合酶對堿基的選擇功能）2、需二價正離子如Mg＋，3’-OH作親核進攻形成磷酸二酯鍵3、鏈沿5’3’方向延長4、堿基互補配對，若錯配則切除掉（一）DNA復制體(replisome)DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發體和解旋酶構成的復合體第四章DNA的復制2（三）防止拓撲學問題兩種機制[1]DNA在生物細胞中本身就是負超螺旋，當DNA解鏈而產生正超螺旋時，可以被原來存在的負超螺旋所中和[2]DNA拓撲異構酶Ⅰ可以打開一條鏈，使正超螺旋狀態轉變成松弛狀態；DNA拓撲異構酶Ⅱ(旋轉酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續將負超螺旋引入雙鏈DNA第四章DNA的復制2nick結合PolI引物移動/DNA合成封閉缺口降解的引物DNAligase（四）缺刻平移(Nicktranslation)去除引物5′5′3′3′parentprogeny第四章DNA的復制2AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATT