重組技術之表達系統體系選擇研究基因功能:

大腸桿菌,裂殖酵母,昆蟲細胞,CHO細胞多肽藥物生產:

大腸桿菌,畢氏酵母,CHO細胞,乳腺組織疫苗:

大腸桿菌,酵母,

大多數沿用細胞培養產物進行滅毒單抗生產:

雜交瘤細胞工業酶生產:

各種微生物

第2頁,共116頁，2024年2月25日，星期天一、體外表達系統（無細胞表達系統）第3頁,共116頁，2024年2月25日，星期天體外翻譯系統又稱無細胞蛋白質合成系統，是一種相對胞內表達系統而言的開放型表達系統。優點：內源型mRNA干擾很小，操作程序簡單，獲得重組蛋白周期很短。主要用于蛋白質快速分析鑒定；基因轉錄和翻譯調控機理研究；分子間的相互作用的研究。缺點：昂貴；操作要求高；表達量不夠高。第4頁,共116頁，2024年2月25日，星期天主要的體外表達系統：1、兔網織紅細胞系統，由新西蘭大白兔制備。2、麥胚提取物系統，可穩定地表達一些在兔網織紅細胞中翻譯受到抑制的DNA。3、原核體外翻譯系統（S30原核體外翻譯系統），E.coliS30提取物由OmpT內切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coliB菌株制備，所以在S30系統中表達基因可以增加產物的穩定性。第5頁,共116頁，2024年2月25日，星期天目前多家公司有商業化產品，常見的有：RTSE.Coli系統;RTS100wheatgermCECF系統(Roche)TNT?快速偶聯轉錄/翻譯系統(Promega)；GoldTNT?T7Express96系統（Promega），該系統有SP6和T7兩種類型，適合在96孔板上進行大規模高通量篩選分析；TNT?T7QuickforPCRDNA(promega)，PCRDNA的TNT?T7快速系統從PCR反應液中直接取樣，無需純化DNA，直接用于偶聯的轉錄/翻譯反應；

TNT?偶聯小麥胚芽抽提系統(promega)。第6頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共116頁，2024年2月25日，星期天二、原核表達系統第8頁,共116頁，2024年2月25日，星期天特點：產量高、生長速度快、操作容易、成本低。

缺點：翻譯后加工修飾體系不完善：無糖基化、酰基化等一般表達獲得的蛋白常常以變性狀態存在，不具有生物學活性。

（一）大腸桿菌表達系統第9頁,共116頁，2024年2月25日，星期天目前較常用的表達載體是具有可誘導的T7啟動子的表達載體，大部分蛋白均可獲得表達而且表達量較高，表達量可占細菌總蛋白的25％以上。T7RNA聚合酶來源于T7噬菌體，期活性高于大腸桿菌RNA聚合酶很多倍，而且較少發生轉錄中止它只識別自己的啟動序列，不能啟動大腸桿菌DNA的轉錄，對抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的條件下，使目的基因得到大量擴增正常大腸桿菌并不表達T7RNA聚合酶，為了能利用T7啟動子表達外源基因，將T7RNA聚合酶基因置于lacUV5啟動子控制下，整合到大腸桿菌染色體，構建了能被IPTG誘導表達T7RNA聚合酶的大腸桿菌菌株常用宿主細胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等還有受溫度變化誘導的具有λ噬菌體PL啟動子調控

的載體等。

第10頁,共116頁，2024年2月25日，星期天按蛋白質類型分單純表達:pJLA系列,用NcoI/NdeI導入AUG的載體融合表達:融合各種tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc

分泌表達:pel/ompT分泌肽按啟動子分lac及衍生的tac,trc,pac,rac等啟動子IPTG誘導lamdaphagePL和PR

啟動子熱誘導T7啟動子IPTG誘導T5啟動子IPTG誘導ara啟動子阿拉伯糖誘導大腸桿菌表達載體分類第11頁,共116頁，2024年2月25日，星期天常見的大腸桿菌商業化表達系統有：1、pETsystemandpETBlue?system（Novagen公司），是原核蛋白表達中應用最多的系統。具有可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌。目前共有包括40多種載體、15種不同宿主菌和配套齊全的用于有效檢測和純化目標蛋白的相關產品。

基本結構由T7啟動子、核糖體結合位點、信號肽序列、多克隆位點、T7轉錄終止信號、氨芐青霉素抗性基因核質粒復制位點等有可以表達N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同質粒。也可以表達非分泌性蛋白2、pBAD表達系統（Invitrogen公司），可控制蛋白質的生產水平低于其成為不溶性蛋白的域值。通過與硫氧還蛋白的融合來增加溶解度

3、QIAexpressExpressionSystem（Qiagen公司

）。第12頁,共116頁，2024年2月25日，星期天pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列(T7promoter,Novagen公司)pQE系列(T5promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周質表達,BioLabs公司)pGEX系列(GST融合表達,Pharmacia公司)pBAD系列

(Arabinose誘導型)常用表達載體pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs)第13頁,共116頁，2024年2月25日，星期天BL21(DE3)/pLysS:

自身表達T7RNApolymerase

適用pET系列等帶T7啟動子的載體M15/SG13009:

自身表達T5RNApolymerase

適用pQE系列等帶T5啟動子的載體BL21TrxB(DE3):

thioredoxinreductase突變

Origami:

thioredoxinreductase/glutathionereductase雙突變適合帶thioredoxinreductase的融合表達載體,幫助形成更多的二硫鍵BR21CodonPlusRIL:

富含AT的真核生物基因的表達BR21CodonPlusRP:

富含GC的真核生物基因的表達特殊的表達用菌株第14頁,共116頁，2024年2月25日，星期天外源基因在原核細胞中的表達形式按表達蛋白的部位分：分泌表達；外周質及膜上表達；胞內表達。第15頁,共116頁，2024年2月25日，星期天外源基因在原核細胞中的表達形式

在原核細胞中表達外源基因時，可產生融合型、非融合型。原則上應能夠使外源基因表達效率高，蛋白質產量高，不易被細菌分解，而且產物易被提取、純化。

第16頁,共116頁，2024年2月25日，星期天融合基因的表達

外源基因在大腸桿菌中表達的一種簡便方法是使其表達為融合蛋白，也就是說要表達的外源基因連接在一段原核基因的下游，蛋白質的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由外源DNA的完整序列編碼，這樣的蛋白質由1條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白質結合在一起，故稱為融合蛋白。第17頁,共116頁，2024年2月25日，星期天融合蛋白的特點①轉錄和翻譯起始從正常的大腸桿菌序列開始，故通常可以產生高水平的融合蛋白；②融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩定；③產生的融合蛋白較大，容易從蛋白質凝膠電泳中區別出夾，而且融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經冷凍于燥，磨成粉末后即可作為抗原；④有些融合蛋白帶有信號肽，可以分泌到細胞外。這有助于蛋白質的分離和純化。第18頁,共116頁，2024年2月25日，星期天融合方式6×HisTag融合半乳糖苷酶融合

trpE融合蛋白谷胱甘肽S－轉移酶（GST）融合硫氧還蛋白（Trx）融合麥芽糖結合蛋白（MBP）融合

堿性磷酸酶（phoA）啟動子和信號序列

第19頁,共116頁，2024年2月25日，星期天ProteinAGST（glutathioneS-transferase）CBD(chitin-bindingdomain,BioLabs;cellulose-bindingdomain,Novagen)calmodulin-bindingdomain,Stratagene)MBP(maltose-bindingprotein)GFP(greenfluorescenceprotein)Thioredoxin**幫助二硫鍵形成Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)**二硫鍵的形成與SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀各種融合蛋白表達載體幫助可溶化幫助分泌到周質可用親和層析純化第20頁,共116頁，2024年2月25日，星期天His-tag(6-8Histidine)T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL)各種用于抗體識別的標記第21頁,共116頁，2024年2月25日，星期天如果所表達的蛋白質有二硫鍵并需要正確的立體結構,盡可能進行可溶性表達;如果所表達的蛋白質沒有二硫鍵或只用來制備抗血清,采用包含體表達比較好;如果希望表達的多肽的分子量小于10kDa,一定要進行融合表達第22頁,共116頁，2024年2月25日，星期天采用MBD融合采用GST融合采用CBD融合采用thioredoxin融合采用Origami等宿主菌降低菌體培養的速度溫度(15-30℃),

降低轉速

讓表達產物可溶化第23頁,共116頁，2024年2月25日，星期天采用CBD融合(pET36/37)采用Dsb融合(pET39/40)采用帶pelB/ompT引導肽的載體

(pET12/20/22)采用帶MBD融合(pMAL載體,Biolabs)采用帶SUMO融合

(pETSUMO,Invitrogen)讓蛋白質分泌到間質去第24頁,共116頁，2024年2月25日，星期天融合表達的蛋白，在分離純化過程中往往需要去除表達時額外引入的融合片段。因此需要用不同方法將其裂解，通常有：1、化學裂解法：特異識別特定的氨基酸殘基或一組氨基酸殘基。但化學裂解法裂解位點的特異性低，有時可能對目標蛋白產生不必要修飾如：甲酸、溴化氰等

2、酶解法：反應條件溫和，具有高度的特異性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶、膠原酶等。但酶解法成本高

，反應時間長，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目標蛋白中，造成新的污染，提高純化的復雜性。

第25頁,共116頁，2024年2月25日，星期天DTT:

intein的↓Cys

溴化氰:

Met↓Thrombin:

LVPR↓GSFactorXa:

IEGR↓Enterokinase:

DDDDK↓PreScissionTMprotease:

LEVLFQ↓GPGenenaseITMPGAAHY↓TEVprotease:

ENLYFQ↓G融合蛋白的專一性切割第26頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3、IMPACT系統(inteinmediatedpurificationwithanaffinitychitin-bindingTag)該系統是由枯草桿菌來源的幾丁質結合域（5kD，chitinbindingdomain，用于親和純化）和酵母蛋白質剪接元件

intein組成一個雙效的融合標簽。

intein在較低的溫度和還原條件下發生自身介導的N端裂解，釋放出與之相連的目的蛋白。因此融合蛋白無需蛋白酶裂解即可實現目的蛋白與fusiontag的精確切割。但含有較多二硫鍵的蛋白不適合這一系統。

第27頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分泌型表達

為減少所需蛋白質在宿主體內被蛋白酶降解。或者使蛋白質能夠在體外正確折疊和便于提純，經常需要將被表達的蛋白質分泌到細胞外，因此要用分泌型載體。第31頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分泌型載體的優點①一些在胞內被蛋白酶降解的蛋白質在細胞周質中很穩定；②一些在胞內無活性的蛋白質在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白質能夠正確折疊；③產生的蛋白質沒有氨基末端甲硫氨酸，因為切割位點在信號肽與編碼序列之間，甲硫氨酸會影響許多蛋白質的活性。第32頁,共116頁，2024年2月25日，星期天蛋白質能夠在大腸桿菌中進行分泌，至少要具備3個要素：①有一段信號肽；②在成熟蛋白質內有適當的與分泌相關的氨基酸序列；③細胞內有相應的轉運機制。第33頁,共116頁，2024年2月25日，星期天信號肽長度一般為15—30個氨基酸殘基真核生物和原核生物的信號肽在結構上都有以下特征：①信號肽一般都不長，在氨基末端有一段帶正電荷的氨基酸序列，往往是精氨酸或賴氨酸殘基，其數目為1—3個；②有一個高度疏水的核心區，含亮氨酸或異亮氨酸殘基，位置可以從帶正電荷的氨基酸延伸到含切割位點的區域；③含有能被信號肽酶水解的切割位點，這個位點常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或絲氨酸之后第34頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

分泌型載體也有缺點，例如目的蛋白質的產量往往很低，以及信號肽不能被切除或切在錯誤位置上等。第35頁,共116頁，2024年2月25日，星期天非融合蛋白的表達

指在細菌內表達的蛋白質以真核蛋白質mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細菌多肽序列。優點：表達產物的生物學功能接近于生物體內天然蛋白質。缺點：容易被細菌蛋白酶破壞。第36頁,共116頁，2024年2月25日，星期天包含體（包涵體）表達的蛋白質經常是不溶的，會在細菌內與細菌雜蛋白、核酸等成分形成不溶性聚合體即包含體（inclusionbody），尤其當表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體生成包涵體的原因可能有是蛋白質合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，影響了多肽鏈的正確折疊，導致疏水基團外露等。第37頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

包含體的形成有利于防止蛋白酶對表達蛋白的降解，并且非常有利于分離表達產物。但包含體形成后，表達蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包含體并對表達蛋白進行復性。第38頁,共116頁，2024年2月25日，星期天包含體的制備可通過常規方法如超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后則可得到高純度的包含體包含體通常不溶于水，加入強蛋白質變性劑后方可溶解根據包含體中蛋白質種類的不同，通常用6—8mol／L鹽酸胍或9～10mol／L尿素溶解包含體。采用pH2．0～4．5的酸性溶液也可使包含體溶解。第39頁,共116頁，2024年2月25日，星期天形成包含體的表達蛋白恢復其活性的過程稱為包含體蛋白質復性其基本原理是隨著變性劑濃度的降低，表達蛋白恢復其天然構型常用的復性方法有逐步稀釋法或透析法等。第40頁,共116頁，2024年2月25日，星期天透析法:簡單;但費時,費緩沖液,蛋白質濃度不能過高(容易產生沉淀)快速稀釋法:

最常用的小規模復性方法;但比較費時,費緩沖液,蛋白質的濃度不能高(容易產生沉淀)

超濾透析法:比較省緩沖液,處理量大;但費時,要控制好蛋白質濃度凝膠過濾法:

快速,可重復性高,不會產生沉淀,操作復雜一點

親和層析復性法,水相二相法,etc包含體來源蛋白質的復性第41頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（二）枯草芽孢桿菌表達系統Spizizen于1958年發現枯草桿菌168菌株為可轉化菌株以來，枯草桿菌的遺傳學工作不斷深入和發展枯草桿菌的研究之所以領先于其他芽孢桿菌的種，主要是由于他的轉化、轉導方法較完善，以及大量的衍生菌株A.芽孢桿菌的分類除枯草桿菌外，已報導用作宿主表達克隆基因的有：嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和耐堿的芽孢桿菌以及病原菌炭疽芽孢桿菌等12種

B.枯草芽孢桿菌168的基因組序列測定已完成第42頁,共116頁，2024年2月25日，星期天芽孢桿菌表達系統的優點-----相對于大腸桿菌1、非致病性：除個別種（炭疽芽孢桿菌和臘樣芽孢桿菌）外對人畜無害2、轉化外源DNA的感受態系統也同樣適用于轉化重組DNA3、質粒和噬菌體都可以作為克隆的載體

4、細胞壁的組成簡單，只含有肽聚糖和磷璧質，因此在分泌的蛋白質產品中不會混雜有胞被內毒素（熱源性脂多糖），而這一點是大腸桿菌無法比擬的

5、能夠大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越細胞膜后，被加工和直接釋放到培養基中而不發生聚集，回收和純化蛋白較為簡單。例如：α淀粉酶、蛋白酶及殺蟲晶體蛋白等與革蘭氏陰性（大腸桿菌）相比，陽性菌（芽孢桿菌）簡單的細胞壁結構賦予了它高效地向胞外分泌目的蛋白的能力,這樣從而使得目的蛋白的純化相對比較簡單芽孢桿菌擁有一套高效的分泌信號肽及分子伴侶系統。可完成目的蛋白的高效分泌表達，從而避免包涵體形成

6、良好的發酵基礎和生產技術，在相對簡單的培養基中能生長到很高的密度第43頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共116頁，2024年2月25日，星期天芽孢桿菌的缺點如下：1、能夠產生大量的胞外蛋白酶，往往造成表達產物的大量降解。

2、能自發形成感受的的菌株極少，感受態持續時間短暫，分子克隆效率低

3、存在限制和修飾系統，重組質粒不穩定。

第45頁,共116頁，2024年2月25日，星期天芽孢桿菌常用的宿主已報導用作宿主表達克隆基因的有Brevibacillusbrevis（短短芽孢桿菌）、嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和耐堿的芽孢桿菌以及病原菌炭疽芽孢桿菌等短短芽孢桿菌作為表達菌株的幾個優點：1、幾乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢桿菌至少分泌8種不同的蛋白酶），利于目的蛋白的穩定性2、細胞壁相對于枯草桿菌來講更薄，有利于外源蛋白的分泌3、據研究其發酵液中存在著可以促進蛋白中二硫鍵形成的因子，可以促進外源蛋白的折疊第46頁,共116頁，2024年2月25日，星期天載體：目前，芽孢桿菌中常用的載體主要有自主復制質粒、整合質粒和噬菌體三種從芽孢桿菌中分離的自主復制質粒，除極少數以外（例如pBC16），均為無抗性標志的隱秘質粒帶有抗性標志的自主復制質粒主要來自其它G+細菌，特別是來自金黃色葡萄球菌的質粒。其中廣泛使用的有pUB110、pC194和pE194等。迄今已在上述質粒的基礎上構建了雙標記質粒、芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭質粒、表達質粒、整合質粒和探針質粒等第47頁,共116頁，2024年2月25日，星期天絕大多數的載體在陽性菌中的拷貝數都非常低。采用整合質粒將克隆基因整合到宿主染色體，是克服芽孢桿菌質粒不穩定性的一個有效的途徑整合的目的一般通過同源重組或者轉座子插入來實現。這種質粒的基本結構是在大腸桿菌質粒的基礎上增加一個芽孢桿菌的抗性標志，以及待整合的目的基因。它在大腸桿菌中進行基因克隆或亞克隆操作。整合質粒導入芽孢桿菌后，由于它沒有芽孢桿菌質粒的復制起點而不能自主復制，只有插入到宿主體后，隨著細胞復制而復制。在含有整合質粒中芽孢桿菌抗性標志的抗生素的培養基上，就可以很容易挑出這種整合體整合質粒另一個重要的用途是用于目的基因的敲除。不少噬菌體都可用作載體，如Φ105噬菌體，SPβ噬菌體及其它噬菌體。其中Φ105噬菌體應用較多，它是一個溫和噬菌體，基因組約為39.2Kb，從中發展了不少載體。目的基因一般在體外“包裝”之后，經噬菌體介導（轉導）而進入宿主菌進行表達第48頁,共116頁，2024年2月25日，星期天其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)蘇云金桿菌

(Bacillusthuringiensis)第49頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共116頁，2024年2月25日，星期天三、真核表達系統第51頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（一）酵母表達系統優點：1、基因背景了解清楚，上游操作簡單，生長迅速，非常適于大規模發酵。2、具有一定的加工及修飾能力：如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工。表達產物與天然蛋白相同或類似。3、可將異源蛋白基因與N-末端前導肽等信號肽融合，指導新生肽的分泌，在分泌中可對表達的蛋白進行糖基化修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細胞并不相同。4、可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應問題。

第52頁,共116頁，2024年2月25日，星期天缺點：產糖量過多因而損壞蛋白質的生物活性、安全性等；糖基化修飾與高等真核細胞并不相同。

第53頁,共116頁，2024年2月25日，星期天載體：均為大腸桿菌和酵母菌的“穿梭”質粒。有附加體型載體和整合體型載體兩種。常用啟動子：GAL1、AOX1、AUG1、TEF1等。酵母表達系統載體有：1、整合型載體:導入酵母宿主細胞后與酵母細胞染色體基因組DNA整合，穩定性高，但基因拷貝數低。

2、附加體型載體：在酵母宿主中拷貝數量大，但在傳代過程中易丟失，影響重組菌的穩定性和表達量。

第54頁,共116頁，2024年2月25日，星期天常見宿主有：釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、巴氏畢赤酵母等。釀酒酵母表達系統多為附加型載體，巴氏畢赤酵母，多形漢遜酵母表達系統為整合型載體。克魯維酵母表達系統則兼而有之釀酒酵母表達系統缺乏強有力的啟動子，分泌效率差，表達質粒易于丟失目前，畢赤酵母表達系統是應用最廣泛的酵母表達系統它以甲醇作為唯一的碳源。產量較高。翻譯后的加工更接近哺乳動物。如日本綠十字公司利用該系統可以達到公斤級水平的人血清白蛋白的生產。第55頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

商品化酵母表達系統有畢赤酵母（Pichia）系統（invitrogen）和Saccharomyces釀酒酵母表達系統（invitrogen）畢赤酵母系統重組蛋白表達量可高達12g/L，表達量最高。第56頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（二）昆蟲細胞表達系統

昆蟲細胞表達系統是以桿狀病毒為載體，昆蟲細胞為宿主的表達系統。

1、表達效率高。重組蛋白的表達水平最高可達到細胞總蛋白的50％。2、屬于真核表達系統。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表達產物形成天然的高級結構，保持原有的生物活性與功能。3、桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。第57頁,共116頁，2024年2月25日，星期天4、桿狀病毒屬于昆蟲病毒。具有高度特異的宿主范圍，對脊椎動物和植物均無致病性。病毒重組因失去多角體保護，在自然界的生存能力很弱，因此比較安全。5、應用晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因可表達毒性蛋白。

6、桿狀病毒表達載體通用性廣。可表達來自病毒、細菌、真菌、植物和動物幾乎所有的蛋白，并且能表達帶有內含子的外源基因。

7、重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養細胞表達外源基因外，還能感染昆蟲活體，在體內高效表達外源蛋白。第58頁,共116頁，2024年2月25日，星期天缺點：宿主細胞生長慢培養基昂貴含有免疫宿主蛋白、

桿狀病毒感染會導致宿主死亡、因此每一輪蛋白合成均需重新感染昆蟲細胞內的糖基化方式與脊椎動物細胞內的糖基化方式有一定的差異，其糖蛋白的糖鏈結構多為簡單的不分支結構。

第59頁,共116頁，2024年2月25日，星期天啟動子采用多角體蛋白啟動子。宿主細胞通常來源于雙翅目昆蟲，包括果蠅、蚊子。來源于草地夜蛾（Spodopterafrugiperda）的Sf9細胞系是最常用的宿主細胞。商品化系統：BaculoDirect?桿狀病毒表達系統（invitrogen），典型的桿狀病毒表達系統是利用大腸桿菌中位點特異的轉座或昆蟲細胞中的同源重組來產生重組桿狀病毒。DES?-Drosophilaexpressionsystem結合了昆蟲細胞高表達水平和哺乳動物細胞的穩定表達的優點。第60頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（三）哺乳動物細胞表達系統

哺乳動物細胞表達系統是生產天然蛋白的理想表達系統，是目前應用最廣泛的動物細胞表達系統。其優點和缺點都極其顯著。產物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質最接近，糖基化等后加工最精確。一般會產生正確加工的、有活性的蛋白。第61頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

但該表達系統的表達水平較低、培養基昂貴、生長緩慢、含有過敏物質等缺點在實際應用過程中較難避免。哺乳動物細胞表達系統通常用來生產用常規方法無法獲得的真核細胞蛋白。如EPO，TNF受體，基因工程單抗等。

CHO（中國倉鼠卵巢）是目前重組糖蛋白生產的首選體系。

第62頁,共116頁，2024年2月25日，星期天載體：1、病毒性載體系統，包括逆轉錄病毒載體及其它DNA病毒載體。優點：能夠高效導入外源基因。缺點：包裝時對其基因組的長度有嚴格的限制，插入外源基因一般較短。2、質粒性載體系統。優點：適用于多種細胞；安全。

缺點：導入外源基因的效率不如逆轉錄病毒。

第63頁,共116頁，2024年2月25日，星期天商品化系統：ViraPower?慢病毒表達系統，是第一次實現在不分裂的哺乳動物細胞中進行穩定的高水平基因表達。Adeno-X?表達系統－最有效的腺病毒系統之一。BDAdeno-X?ExpressionSystem(Clontech)可以在2周內獲得高效價的腺病毒，其效率遠高于其他腺病毒系統。BDAdeno-X?Tet-On?&Adeno-X?Tet-Off?ExpressionSystems(Clontech)可表達毒性蛋白質。BDRevTet-On?&RevTet-Off?GeneExpressionSystems(Clontech)表達效率高。

第64頁,共116頁，2024年2月25日，星期天新霉素抗性選擇系統

新霉素是細菌抗生素，它可以干擾原核生物的核糖體，使其蛋白質合成不能正常進行，而真核細胞核糖體則不受新霉索的影響。新霉素的一種類似物G418(geneticin)對真核細胞和原核細胞均有毒性。第65頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

細菌的新霉素抗性基因(neor)能在真核細胞表達。neor基因編碼一種磷酸轉移酶，這種酶能使G418失活。所以，當細胞表達了這種neo抗性基因后就會在含有G418的選擇培養基中存活，這種選擇系統適用于所有的細胞類型。第66頁,共116頁，2024年2月25日，星期天外源基因導入哺乳動物細胞

目的基因序列與載體連接后，要導入細胞中才能繁殖擴增，再經過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細胞中繁殖，導入細胞的方法也不相同。

第67頁,共116頁，2024年2月25日，星期天轉染方法（一）質粒為載體的物理化學轉染法（二）以病毒為載體的生物學轉染法第68頁,共116頁，2024年2月25日，星期天磷酸鈣法

其利用的基本現象是：DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現時，培養細胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養的哺乳類細胞也能提高細胞攝取DNA能力，但所用外加電場的強度、電脈沖的長度等條件與處理細菌者都很不相同。第69頁,共116頁，2024年2月25日，星期天脂質體

近年來用人工脂質膜包裹DNA，形成的脂質體（Liposome）可以通過與細胞膜融合而將DNA導入細胞，方法簡單而有效，現有商售的脂質體試劑，使用日益廣泛。

第70頁,共116頁，2024年2月25日，星期天顯微注射法

是在顯微鏡直視下，向細胞核內直接注射外源基因，這種方法應是有效的。但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。第71頁,共116頁，2024年2月25日，星期天電穿孔轉染法（electroporation）

用高電壓脈沖短暫作用于細菌也能顯著提高轉化效率。

第72頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

以病毒為載體的生物學轉染法

將目的基因插入病毒載體，在病毒調控元件作用下進行表達。作為運載工具的病毒有SV40，人腺病毒，牛乳頭瘤病毒，逆轉錄病毒等。第73頁,共116頁，2024年2月25日，星期天外源基因在真核細胞中的表達方式

常用的表達方式有兩大類：1、瞬時表達2、穩定表達系統第74頁,共116頁，2024年2月25日，星期天瞬時表達系統

瞬時表達的效率取決于吸收DNA的細胞數、基因拷貝數和基因的表達水平，在瞬時表達系統中，吸收DNA的細胞數約為5%~50%。因為沒有整合，隨著細胞的生長，細胞群體中外源基因的含量逐步減少，最后消失。因此瞬時表達系統只能使用數天。第75頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

瞬時表達常用于下列方面：①根據表達活性確證分離到的基因；②研究誘變對蛋白質活性和功能的影響；③分離cDNA文庫中的基因。這種系統的缺點是不能大量繁殖能產生特異蛋白質的細胞，故不能獲得大量的蛋白質(>1mg)，也不能用于研究在特定條件下才能表達的基因。第76頁,共116頁，2024年2月25日，星期天穩定表達系統

如果在轉染DNA后進行篩選。則可能得到外源基因整合到染色體中的穩定表達的細胞。不同品系的細胞轉染和整合DNA的能力不同，而在篩選獲得穩定表達的細胞過程中，整合的能力比轉染的能力更重要。第77頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第78頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（四）轉基因植物第79頁,共116頁，2024年2月25日，星期天與微生物和動物生物生物反應器相比,植物生物反應器有不可替代的優越性1.生產成本較低,易于大規模工業生產。植物能進行光合作用,僅需要來自土壤的礦物質和水分便可在適宜的條件下獲得大量人們所需的轉基因產物2.植物細胞具有全能性,易于獲得再生植株,遺傳操作相對簡單,培養周期較短3.轉基因植物通過自交得到的后代遺傳性狀穩定,從而可以在植物體內積累多基因4.產物貯藏在種子、果實和塊莖中便于貯運,其中那些能直接食用的植物疫苗不需特殊貯存條件第80頁,共116頁，2024年2月25日，星期天5.無毒副作用,安全性好細菌作為生物反應器時,不能對真核生物的蛋白進行有效的翻譯后加工,而且本身可能是人類病原物動物作為生物反應器時,在細胞培養過程中可能感染上動物病毒而對人類健康造成潛在危害植物作為生物反應器被認為是相對安全的,因為植物體只表達病原菌的部分免疫蛋白,不含致病微生物或潛在的致病微生物,對人蓄安全,大大提高了表達產物的生物安全性6.植物中的蛋白加工途徑相對保守,表達產物能進行正確的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻譯后加工過程,因此表達產物具有與高等動物細胞一樣的免疫原性和生物活性第81頁,共116頁，2024年2月25日，星期天植物轉基因主要方法農桿菌導入法這種方法是將農桿菌與植物細胞共同培養,用農桿菌整合的目的基因的質粒去轉化植物細胞,然后通過組織培養,獲得轉基因植株基因槍法這種方法用表面附著DNA分子(含目的基因)的金屬微粒,經過加速裝置,轟擊植物細胞,將DNA直接射入植物帶壁的細胞,轉化率可達8%～10%。這種方法不受受體種類限制,快速簡單,但設備昂貴花粉管通道法將目的基因整合后,在植株開化時利用花粉管通道直接導入受體植株。這是我國科學工作者發明的方法,主要用于棉花轉基因研究。第82頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共116頁，2024年2月25日，星期天轉基因植物在醫藥中的應用疫苗藥用蛋白第84頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第85頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第86頁,共116頁，2024年2月25日，星期天轉基因植物表達體系的問題及解決方案1、外源蛋白表達量低蛋白質靶向定位定位到合適的亞細胞部位，如細胞質、內質網腔、葉綠體、液泡等。外源基因整合到葉綠體基因組后表達量最大可達到葉片可溶性蛋白的46.1%對外源基因進行優化使用植物偏好密碼子優化前導肽序列，取出mRNA中不穩定序列和無效抑制序列，并同時表達有助于正確折疊的酶或蛋白質，如分子伴侶等合理選擇啟動子并加以改造使用增強子序列，利用組織特異性的啟動子，或者人工構建復合式啟動子如與花椰菜花葉病毒35S啟動子相比，增強型雙35S啟動子可以使外源基因轉錄效率高出10倍第87頁,共116頁，2024年2月25日，星期天使用核基質附著區MAR序列利用染色質高級結構的特點，將MAR連接于外源基因兩側，可使外源基因稱為一獨立的轉錄單元，減少周邊序列的影響。即可避免外源基因表達的位置效應，又可提高外源基因在轉化細胞中的穩定性和表達水平使用植物病毒表達載體病毒載體在宿主細胞中能夠反復復制且繁殖速度快，可使外源基因在短時間內大量積累并高效表達第88頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2、下游加工成本高對基因表達產物進行提純費用較高合理選擇受體系統，如將外源基因整合到直接是用的植物中或植物的可食器官即可避免或部分避免表達產物的加工如香蕉：易消化、口感好，且在熱帶和亞熱帶常年生長，是食用疫苗的理想宿主3、安全性問題植物種類的安全性，如煙草的煙堿污染外源基因對生態環境的影響第89頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（五）轉基因動物技術及其新藥研發中的應用第90頁,共116頁，2024年2月25日，星期天轉基因動物技術始于80年代初，所謂轉基因動物就是指以實驗方法將外源基因導入動物染色體基因組內穩定整合并能遺傳給后代的一類動物。近十年來，轉基因動物研究發展十分迅速，已先后建立了許多整合有外源基因的轉基因小鼠和大鼠，轉基因魚、兔、豬、羊、牛等也已誕生。由于轉基因動物體系打破了自然繁殖中的種間隔離，使基因能在種系關系很遠的機體間流動，它將對整個生命科學產生全局性影響，因此轉基因動物技術在1991年第一次國際基因定位會議上被公認為遺傳學中繼連鎖分析、體細胞遺傳和基因克隆之后的第四代技術，被列為生物學發展史上126年中第14個轉折點。第91頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第92頁,共116頁，2024年2月25日，星期天一、轉基因動物的技術研究

▲步驟：構建功能基因轉移生殖細胞假孕母體發育

→表型分析轉基因動物第93頁,共116頁，2024年2月25日，星期天▲方法：

原核DNA顯微注射法(PronuclearDNAmicroinjection)多能性干細胞法（Pluripotentstemcells）病毒載體法（viralvectors）精子介導的基因轉移法（Sperm-mediatedgenetransfer）核轉移法（nucleartransfer）

第94頁,共116頁，2024年2月25日，星期天1.原核顯微注射法第95頁,共116頁，2024年2月25日，星期天▲原核顯微注射法優缺點：優點：1.整合效率高；2.外源基因長度可達數百Kb；3.直接獲得純系動物，實驗周期相對較短。缺點：1.設備昂貴、操作復雜；2.隨機整合、拷貝數無法控制；3.常造成插入位點附近宿主DNA大片段缺失、重組等突變，出現動物嚴重生理缺陷。第96頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2．多能性干細胞法

主要是胚胎干細胞（EmbryonicStemCell，ESC），是從早期胚胎的內細胞團經體外培養建立起來的多潛能細胞系，具有胚胎細胞相似的形態特征和分化特征。在適當的條件下可參與胚胎構成，從而產生嵌合體動物。

ESC法是在基因組相應位點進行同源重組或置換，而將外源DNA定向整合到內源基因組中表達。第97頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

第98頁,共116頁，2024年2月25日，星期天▲胚胎干細胞法的優缺點：優點：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個特殊的基因型；用外源DNA轉染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉基因動物。第99頁,共116頁，2024年2月25日，星期天缺點：

許多嵌合體轉基因動物生殖細胞內不含有轉基因，須進一步雜交才能獲得轉基因動物。

第100頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3．病毒載體法

將目的基因以RNA分子的形式重組到逆轉錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞共孵育以達到感染的目的。然后在逆轉錄整合酶和逆轉錄病毒基因組末端的特異性核酸序列的作用下，目的基因將被反轉錄并整合到宿主基因組中去。第101頁,共116頁，2024年2月25日，星期天▲病毒載體法優缺點：優點：1.目的基因呈單一位點單拷貝整合、整合率高；2.插入位點克隆分析較容易；缺點：1.不安全；2.轉入基因的承載能力有限，一般小于10Kb；3.所得轉基因動物的嵌合性很高，建立轉基因系需要廣泛的雜交；4.逆轉錄病毒基因組兩側的長末端重復序列（longterminalrepeats,LTRs）會影響哺乳動物的啟動子或引起錯誤表達，其甲基化狀態常使轉基因的表達缺失第102頁,共116頁，2024年2月25日，星期天4．精子介導的基因轉移法

在精子后頂體區域有一種DNA結合蛋白（DBPs），它可以介導外源DNA與精子表面結合。受精后外源DNA即可整合于染色體中。簡單、方便，依靠生理受精過程，免去了原核的損傷。主要有三種方式：胞質內精子注射途徑（ICSI）、電轉移或脂質體轉染途徑、睪丸體內轉染途徑第103頁,共116頁，2024年2月25日，星期天5．核轉移法1996年，Schnieke用人類因子IX（humanfactorIX）轉染綿羊胎兒纖維母細胞，再將轉染細胞的細胞核通過核轉移得到HFIX轉基因綿羊。將供體細胞核轉入到受精卵的胞質或MII期卵母細胞中，供體細胞的核以及胞質成分，包括線粒體等，就都會被轉移。后者可能會促使胚胎重構、胎兒發育以及分娩新生個體。第104頁,共116頁，2024年2月25日，星期天與DNA顯微注射法相比：

1.根據具體方案的要求可選擇雄性或雌性細胞株；2.序列的整合和表達在轉染后，細胞用于核供體之前就可以檢測；3.轉染的細胞可以凍存長期保存；4.在一個克隆動物體內的所有細胞都含有目的基因，避免了遺傳差異性，并確保生殖細胞也轉移了目的基因；5.得到轉基因動物的效率比顯微注射幾乎高一倍。第105頁,共116頁，2024年2月25日，星期天6.轉基因動物的誘導表達系統外源基因轉入動物體內后，其過量表達常常會對胚胎的發育產生毒性作用甚至致死作用，從而影響了表型的分析甚至無法獲得轉基因系。目前發展比較成熟的轉基因可誘導表達系統主要有兩種[18]：四環素誘導系統（tet系統）和Cre/loxP重組酶系統。第106頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

這兩個系統均需要制備兩個系列的轉基因動物，一個系列表達具有選擇性組織特異性啟動子調控下的激動子[依賴于四環素調控的反式作用子/反向反式作用子（transactiv