一、任務來源

本國家標準的制定任務列入國家標準化管理委員會計劃項目，項目編號為

20182192-T-424。本項目由中國標準化研究院提出并歸口，定于2019年完成。

本標準起草工作由河北醫科大學等單位共同完成。

二、標準制定目的及意義

DNA甲基化是DNA的一種序列修飾，即胞嘧啶發生了一個甲基基團的修

飾。哺乳細胞中，甲基化主要發生在CG中的胞嘧啶（C）上，而植物細胞中胞

嘧啶甲基化的形式更為廣泛。多項研究表明，DNA序列雖然未發生改變，但

DNA甲基化能修飾會引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋

白質相互作用方式的改變，從而影響基因的表達；同時，DNA甲基化是個可逆

的過程，通常DNA甲基化能關閉某些基因的活性，而去甲基化則誘導了基因

的重新活化和表達。

焦磷酸測序可具體分析DNA甲基化程度，可對每個CpG或CpN進行甲基

化定量，無需克隆就能獲得可靠、高靈敏度的結果；分析速度快，幾小時就能

獲得定量結果。在醫療診斷、法醫檢測、及植物研究中均有重要應用。研究顯

示，腫瘤的發生和生長與DNA甲基化的變化有關。采用焦磷酸測序定量檢測

DNA甲基化水平，可以對癌癥進行早期篩查，對腫瘤進行分類，并可預測、監

控藥物治療反應。在法醫常規工作中，經常會碰到無法和數據庫配對的犯罪嫌

疑人或受害者檢身份信息的情況，而焦磷酸測序通過甲基化位點檢測，能為犯

罪嫌疑人或受害者的年齡鑒定提供更準確的判定標準。測序準確率高，可以大

大地縮小篩選的范圍，提供一個更加客觀的年齡判定標準。在植物科學研究

中，常需要鑒別純合子、雜合子和多倍體不同雜合狀態，焦磷酸測序技術可以

靈敏地對甲基化頻率進行快速定量，且焦磷酸測序不僅可以檢測CpG甲基化位

點，還可以檢測非CpG甲基化位點，適用于植物研究。

三、標準制定原則和依據

嚴格按照GB1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫規

則》的要求，制定該項國家標準。

四、主要工作過程

主要起草單位河北醫科大學開展的主要工作過程如下：

1、2017年1月，組成標準起草工作組，安排了工作進度。

2、2017年1月~2017年3月，起草工作組查閱了國內外有關標準中關于此方

法的規定，調研了國內外有關DNA甲基化檢測方法的情況，起草了標準討論

稿。

3、2017年4月，標準起草工作小組對標準討論稿進行了討論，形成第二輪

標準討論稿。

4、2017年5月，征求專家意見，形成第三輪標準討論稿。

5、2017年3月~2017年11月，對目前多種DNA甲基化檢測方法進行驗證。

6、2017年12月，召開標準研制推進會，對標準研制過程中的問題進行討

論，商討解決方案。

7、2018年1月，標準起草工作組邀請專家對標準討論稿提出意見。

8、2018年2月~2018年5月，進一步對標準討論稿進行修訂，形成標準草

案。

9、2018年10月，本標準經國家標準化管理委員會批準，獲得立項。

10、2018年10月，完成標準征求意見稿和編制說明的初稿。

11、2018年11月，完成第三方論證，召開專家征求意見會，進行充分討

論，進一步根據專家意見修改和完善征求意見稿。

13、2018年12月~2019年2月，向全社會征求意見，并向中國科學院、中國

農科院、清華大學、北京大學、中國醫科大學、首都醫科大學、河北省食品監

督檢驗研究院、河北師范大學、河北醫科大學第四醫院、河北省人民醫院、凱

杰生物技術（中國）有限公司等高校、科研院所、企業、政府單位發函征求意

見。截至到2019年3月1日，共收到7封意見書。編寫組對意見進行認真研究，采

納40條，未采納3條，并對文中相應部分進行了修改與完善，形成了標準送審

稿。

14、2019年5月，中國標準化研究院組織專家進行審查。

五、主要技術內容

在本標準制定過程中，隨著研究的深入，先后完成標準討論稿、草案和標

準征求意見稿，標準內容不斷完善，并趨于科學合理。根據需要，本標準的主

要技術內容確定為：

（一）前言部分。給出了標準的起草原則、歸口單位、起草單位及主要起

草人。

（二）范圍。給出了本標準的適用范圍。

（三）縮略語。給出了本標準中用到的縮略語。

（四）術語和定義。給出了本標準中用到的相關術語及其定義。

（五）試劑和材料。給出了本標準中用到的化學試劑、緩沖液、試劑盒

等。

（六）儀器設備。給出了本標準所需的儀器和設備。

（七）主要技術內容的說明

1、樣品的選擇

陽性樣品：完全甲基化的樣本

陰性樣品：無甲基化的樣本

測試標本——前列腺組織、精液、前列腺癌組織、乳腺組織、膠質母細胞

瘤、食管上皮細胞、煙草BY-2懸浮細胞、白細胞、血液、唾液等

2、PCR升降溫溫度優化

PCR擴增是焦磷酸測序的重要步驟，其中模板DNA的添加量、PCR程序

設置等，均會影響焦磷酸測序的成功與否。在法醫檢測領域，由于案件檢測的

模板核酸含量很少且珍貴，因此很難對模板添加量進行優化，這就尤其需要對

PCR擴增的程序進行選擇，以達到最佳的擴增效果。我們針對PCR的變溫速度

設計梯度實驗，分別設計1℃/s、2℃/s和3℃/s。實驗模板采用精液樣本，檢測

精液的標記基因ZC3H12D。使用EZ1DNAInvestigator?Kit核酸提取試劑盒提

取DNA，并用AppliedBiosystems?Quantifiler?TrioKi進行核酸定量。亞硫酸

鹽轉化采用EpiTect?FastDNABisulfiteKit試劑盒，程序見表1：

表1.EpiTect?FastDNABisulfiteKit亞硫酸氫鹽轉化程序

轉化后的核酸利用QIAcube儀器進行純化，獲得高質量的核酸，以進行后

續PCR擴增。使用一對擴增引物（其中一條有生物素標記）進行PCR擴增，

獲得擴增產物。擴增程序見表2：

表2.PyroMarkQ48采用的PCR擴增程序

將擴增產物和所需試劑加入焦磷酸測序儀中，儀器自動進行測序引物的分

配，并實時監測測序過程，焦磷酸測序結果如圖1所示。結果表明，核酸通過

低變溫速度PCR擴增，其標記基因ZC3H12D甲基化頻率可以被焦磷酸測序儀

更穩定的檢測，獲得更優的結果。而使用高變溫速度進行PCR擴增，會影響焦

磷酸測序對低頻甲基化的檢測，對于標記基因ZC3H12D的5個甲基化位點的

判斷定量結果穩定性變差。因此，對于受核酸含量限制的檢材檢測而言，在檢

測低頻甲基化時，推薦使用低變溫速度PCR進行擴增。

圖1.采用不同PCR變溫速度所得的焦磷酸測序峰圖。較高的變溫速度（3℃

/s）對ZC3H12DJIA的5個甲基化位點的定量偏高或偏低，而較低的變溫速度

（1℃/s）可獲得更穩定的定量結果。

3、靈敏度檢測

為了分析焦磷酸測序對核酸檢測的靈敏度，使用從精液樣本中提取的

DNA，梯度稀釋后進行焦磷酸測序。結果如圖2所示，焦磷酸測序可以檢測低

至0.05ng的DNA，但是定量檢測結果與實際結果相比略有差異，可能是由于

極微量的核酸導致焦磷酸測序的特異性和準確性有所降低。而使用0.1ng的

DNA上樣，可以獲得準確的甲基化頻率檢測。此外，使用更低的DNA含量—

—0.01ng，則焦磷酸測序無法檢出。實驗表明，此項研究中焦磷酸測序的DNA

檢測靈敏度一般可達0.05ng~0.1ng。

圖2.添加不同DNA量得到的焦磷酸測序結果。A.0.1ngDNA添加量；B.0.05

ngDNA添加量；C.0.01ngDNA添加量

4、方法的重復性驗證

在前列腺癌biomarker研究中，選擇無甲基化的前列腺組織樣本，利用

QIAGENQIAampDNAMinikit進行核酸提取，隨后進行亞硫酸氫鹽轉化及

PCR，設置三個重復，分別的檢測結果如圖3所示。由圖可見，三個重復孔的

對待檢位點的判讀均為2%，說明方法的重復性良好。

圖3.焦磷酸測序對無甲基化樣本的定量重復性的驗證

此外，我們以Oligo（寡核苷酸）標準品為實驗材料，進一步對焦磷酸測序

的重復性進行了驗證。具體過程和結果如下：

（1）性能指標：

對0.5pmol和2pmol的兩組Oligo（寡核苷酸）樣本分別進行檢測，每組

Oligo包括%C含量不同的3份樣本（A(5%)、B(95%)、C(50%)），每份樣

本分別重復測定10次，計算每份樣本測定結果的標準差(SD)，SD≤3%。

注：%C指寡核苷酸某一堿基位點上胞嘧啶的含量。

（2）檢測方法：

使用QIAGENGmbH生產的Oligo驗證試劑盒，根據試劑盒操作程序對各

種濃度樣本（A、B、C）進行檢測，每一濃度重復檢測10孔(各濃度滴入孔中

的排序應嚴格按照說明書中的表格操作)，計算其在0.5pmol和2pmolOligo濃

度下的測得值標準差SD，結果應符合2.2的要求。

（3）檢測結果：

A.0.5pmolOligo檢測結果：

C%A0.025B0.025C0.025A0.025B0.025C0.025

7.7890.8351.68.9592.1155.98

9.8292.8453.28.069351.27

bias&8.8492.5951.279.0192.3452.62

repeatibility9.5192.8552.277.6692.153.15

10.2792.7752.548.792.3555.03

mean8.8692.3852.89

重復性0.860.631.56

STDEV

passedpassedpassed

B.2pmolOligo檢測結果：

C%A0.1B0.1C0.1A0.1B0.1C0.1

6.0794.1253.475.2894.9653.64

6.1394.452.525.2694.8351.62

bias&5.8694.3253.265.8895.1652.05

repeatibility5.5694.8851.677.495.1851.82

695.5952.75.8294.852.28

mean5.9394.8252.50

重復性0.600.440.75

STDEV

passedpassedpassed

進一步的研究結果表明，焦磷酸測序可以對不同甲基化頻率準確定量。實

驗分別使用無甲基化的DNA和完全甲基化的DNA（EpiTectControlDNAs）進

行亞硫酸氫鹽轉化，并針對p16基因進行PCR擴增，然后按照不同比例混合兩

種PCR產物，得到不同甲基化含量（0%~100%）的樣本，隨后使用焦磷酸測序

儀定量檢測甲基化，結果如圖4所示。其中，淺藍色正方形圖示為真實甲基化

頻率，深藍色三角形圖示為焦磷酸測序定量結果，分析表明，焦磷酸測序的定

量結果與真實甲基化頻率之間存在非常好的線性關系，相關指數R2=0.9962。

焦

磷

酸

測

序

甲

基

化

定

量

結

果

（

%）

混合物中甲基化DNA的真實比例（%）

圖4.焦磷酸測序的定量結果與真實甲基化頻率之間有很好的線性關系

5、方法的適用性

焦磷酸測序可用于多個應用領域。在表觀遺傳學領域，DNA甲基化與腫瘤

癌癥、胚胎發育、神經系統疾病等密切相關，焦磷酸測序也被應用于相關樣本

的甲基化檢測，如檢測乳腺組織中ALKBH3基因甲基化，用于乳腺癌相關研

究；檢測FFPE樣本中MGMT啟動子甲基化，用于膠質母細胞瘤患者生存率研

究；檢測食管上皮細胞中EPB41L3基因甲基化，用于食管鱗癌潛在治療靶點研

究。此外，焦磷酸測序也用于檢測Val158Met(rs4680)甲基化水平變化與精神分

裂癥患者的暴力行為的關聯；研究MMP-9CpG島甲基化水平與慢性牙周炎的

嚴重程度的關聯；研究白細胞中ACSL4（CG1553655）基因甲基化與非酒精性

脂肪肝的關聯等。在法醫研究領域，焦磷酸測序檢測從血液、唾液、精液及上

皮組織中提取基因組