用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的lamp引物及應用的制作方法用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的lamp引物及應用的制作方法本發明公開了一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應用。本發明所提供的引物為引物組，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發明利用以上引物，通過在反應液加入SYBR?Green?I熒光染料，建立了IHNV?RT-LAMP可視化檢測方法，且該方法靈敏度高、特異性好、成本低、不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，這對鮭鱒魚魚苗的引種、無特定病原體種魚的培育，以及鮭鱒魚無公害健康養殖均有重要意義?！緦＠f明】用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應用【技術領域】[0001]本發明涉及一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應用。【背景技術】[0002]傳染性造血器官壞死病(infectioushaematopoieticnecrosis,IHN)是由傳染性造血器官壞死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)引起的一種常見的危害鮭鱒魚類的急性病毒性傳染病。自從上世紀50年代在美國首次暴發以來，IHNV已經擴散至歐洲、澳洲、亞洲等十余個國家。IHNV可造成鮭鱒魚魚苗近100%的死亡率，對世界的鮭鱒魚養殖業造成了巨大的經濟損失。因此，實用、快速、靈敏、準確的IHNV檢測技術的建立在IHN早期診斷、水產品衛生質量監督、疫情監測等方面具有重要的意義。目前，世界動物衛生組織推薦的IHN的幾種診斷方法包括細胞培養分離方法、免疫學方法(中和試驗法、間接熒光抗體法和ELISA法)和分子生物學方法(PCR法、PCR探針和序列測定法)。PCR方法是目前最常用的快速檢測方法，已經有以PCR技術為依托的商業化的IHNV檢測試劑盒，這些檢測試劑盒需要專門的儀器或者對PCR產物進行凝膠電泳與紫外線分析才能確定檢測結果。[0003]環介導等溫擴增(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)技術是2000年Notomi等在PCR基礎上創建的另外一種形式的核酸擴增技術。與PCR技術相比，兩者最大的差異在于靶基因引物的設計上。其中，PCR只使用一對與靶基因兩端序列互補的上下游引物，而LAMP則針對靶基因的6個不同區域，設計4種特異引物一內側引物對和外側引物對，必要時再加上環形引物對，對靶基因進行擴增，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行擴增反應，因此其特異性和敏感性均比PCR更高?！景l明內容】[0004]本發明的一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組。[0005]本發明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組，具體可為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；[0006]所述引物I(F3)、所述引物2(B3)、所述引物3(FIP)、所述引物4(BIP)、所述引物5(Loop-F)和所述引物6(Loop-B)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。[0007]所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比可為1:1:8:8:4:4。所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比可為1:1:8:8。[0008]在本發明的一個實施例中，所述引物I(F3)和所述引物2(B3)在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為0.2PM;所述引物3(FIP)和所述引物4(BIP)在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為1·6μΜ;所述引物5(Loop-F)和所述引物6(Loop-B)在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為O.8μΜ。[0009]所述引物組中，引物I(F3)和引物2(Β3)組成外側引物對；引物3(FIP)和引物4(BIP)組成內側引物對；引物5(Loop-F)和引物6(Loop-B)組成環形引物對。序列I由20個核苷酸組成，序列2由20個核苷酸組成，序列3由45個核苷酸組成，序列4由46個核苷酸組成，序列5由18個核苷酸組成，序列6由20個核苷酸組成。[0010]本發明的又一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑。[0011]本發明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑，具體可包括反轉錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和所述引物組。[0012]當所述引物組為所述引物組A時，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴增試劑中的配比可為5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：25mmol：5nmol：IOU：8U0[0013]當所述引物組為所述引物組B時，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴增試劑中的配比可為5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：25mmol：5nmoI：IOU:8U。[0014]在本發明中，所述反轉錄酶具體可為AMV反轉錄酶；所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst2.ODNA聚合酶(如NEB公司產品目錄號為M0537S的產品）或BstDNA聚合酶或BstDNA聚合酶大片段。[0015]在本發明的一個實施例中，所述試劑具體由所述AMV反轉錄酶、所述Bst2.ODNA聚合酶、所述dNTPs、10X等溫擴增緩沖液和所述引物組組成；其中，所述IOX等溫擴增緩沖液的ρΗ8·8，溶劑為水，溶質及其濃度如下：Tris-HC120mM、KC150mM、（NH4)2SO4IOmM、MgS042mM、Tween-20體積分數O.1%。[0016]所述AMV反轉錄酶為Promega公司產品；所述Bst2.ODNA聚合酶為NewEnglandBiolabs公司產品。[0017]在實際使用過程中，上述試劑的各組分在(逆轉錄）環介導等溫擴增反應體系中的終濃度為：所述引物I和所述引物2各0.2μmol/L;所述引物3和所述引物4各1.6μmol/L;所述引物5和所述引物6各O.8ymol/L;所述dNTPslmmol/μL;所述AMV反轉錄酶O.4U/μL;所述Bst2.ODNA聚合酶O.32U/μL;所述IOX等溫擴增緩沖液體積分數10%。[0018]本發明的還一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑盒。[0019]本發明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑盒，含有所述擴增試劑和熒光顯色劑。[0020]所述熒光顯色劑為熒光染料SYBRGreenI(如Invitrogen公司產品）。[0021]如下a)或b)的應用也屬于本發明的保護范圍：[0022]a)所述引物組在制備所述試劑盒中的應用；[0023]b)所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的產品中的應用。[0024]應用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在63-65°C(如63°C或65°C)條件下對所述待測樣品進行時長60min的環介導等溫擴增反應，之后在80°C放置2min終止反應，按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒:向反應體系中加入SYBRGreenI型核酸染料，如果反應液變成熒光綠色，說明待測樣品中含有傳染性造血器官壞死病毒，若反應體系呈現紅棕色，則說明待測樣品中沒有傳染性造血器官壞死病毒，該方法實現了檢測結果的可視化。當然也可將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒，電泳檢測若出現階梯狀DNA條帶，則說明待測樣品中含有傳染性造血器官壞死病毒，若未出現階梯狀DNA條帶，則說明待測樣品中沒有傳染性造血器官壞死病毒。[0025]所述待測樣品來源于淡水或海洋動物，如魚類，具體如鮭鱒魚。[0026]在本發明中，所述傳染性造血器官壞死病毒為感染魚類(如鮭鱒魚)的傳染性造血器官壞死病毒，具體如傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)毒株WRAC(美國典型培養物保藏中心，ATCC*Number:VR-1392TM)。[0027]本發明將逆轉錄環介導的等溫擴增技術(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)引入到傳染性造血器官壞死病毒(infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)檢測中，建立了簡單、快速、靈敏的IHNV檢測方法。針對IHNV的聚合酶蛋白基因(Polymeraseprotein,L)的8個區域設計6條特異性引物，以IHNV基因組RNA為模板，在反轉錄酶和BstDNA聚合酶的作用下進行RT-LAMP，反應產物添加SYBRGreenI熒光染料后，通過肉眼觀察陽性樣本表現為熒光綠色，而陰性樣本表現為紅棕色。該方法實現了檢測結果的可視化。特異性分析顯示該方法不與傳染性胰腺壞死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)及同屬的水生動物病毒性出血敗血癥(viralhaemorrhagicsepticaemiavirus,VHSV)發生交叉反應,并且可檢測不低于IOpfuIHNV的RNA，具有良好的特異性和很高的靈敏性。以上可視化結果均被2%瓊脂糖凝膠電泳證明。本研究所建立的IHNVRT-LAMP可視化檢測方法靈敏度高、特異性好、成本低、不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測。本發明對鮭鱒魚魚苗的引種、無特定病原體種魚的培育，以及鮭鱒魚無公害健康養殖均有重要意義?！緦＠綀D】【附圖說明】[0028]圖1為不同稀釋度病毒懸液感染EPC細胞后在細胞板上形成的空斑。[0029]圖2為RT-LAMP檢測方法反應溫度優化結果。其中，A為可視化檢測結果，1:陰性對照；2-4:61°C、63°C、65°C。B為凝膠檢測結果，泳1:陰性對照；2_4:61°C、63°C、65°C；M:DL2000DNAMarker。[0030]圖3為RT-LAMP檢測方法特異性檢測結果。其中，A為可視化檢測結果，I:IHNV；2:IPNV；3:VHSV；B為凝膠檢測結果，I:IHNV；2:IPNV；3:VHSV；M:DL2000DNAMarker。[0031]圖4為RT-LAMP檢測方法靈敏度檢測結果。其中，A為可視化檢測結果，1_7:5、10、25、50、102、103、104pfuIHNVRNA。B為凝膠檢測結果，1-7:5、10、25、50、102、103、104pfuIHNVRNA；M:DL2000DNAMarker。[0032]圖5為用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑盒的實際應用結果結果。其中，A為可視化檢測結果，1-7:1-7號樣品；B為凝膠檢測結果，1-7:1-7號樣品，M：DL2000DNAMarker?！揪唧w實施方式】[0033]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。[0034]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。[0035]傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)毒株WRAC:美國典型培養物保藏中心，ΛICX'"Number:VR_1392TM。[0036]傳染性膜腺壞死病毒（infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV):美國典型培養物保藏中心，ATCCkNumber：VR-890TM。[0037]水生動物病毒性出血敗血癥（viralhaemorrhagicsepticaemiavirus,VHSV)：美國典型培養物保藏中心，Λ?_α."Number:VR-1387ΤΜ。[0038]AMV反轉錄酶購自Promega公司，其產品目錄號為M5101;Bst2.ODNA聚合酶購自NEB公司，其產品目錄號為M0537S；SYBRGreenI和Trizol購自Invitrogen公司；DKZW-D-2電熱恒溫水浴鍋購自北京市永光明醫療儀器有限公司；凝膠成像系統UniversalHoodII購自BIO-RAD。[0039]實施例I、用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑盒的制備及使用方法[0040]一、用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組的制備[0041]本實施例用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成。這六個引物按照如下方法制備：根據GenBank收錄的IHNV聚合酶蛋白的多條基因序列，進行比對，選取聚合酶基因特異性保守區段，利用在線軟件PrimerExplorerV4(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)針對L基因保守區設計3對RT-LAMP引物，序列見表1，引物由哈爾濱博仕生物公司合成。[0042]表1L基因RT-LAMP弓丨物序列[0043]【權利要求】1.用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增引物組，為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于:所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為1:1:8:8:4:4;所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為1:1:8:8。3.用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環介導等溫擴增試劑，包括反轉錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和權利要求1或2所述的引物組。4.根據權利要求3所述的試劑，其特征在于:所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴增試劑中的配比為5pmol:5pmol:40pmol:40pmol:20p