關于細胞工程植物組織器官培養技術第四章植物組織器官培養技術植物細胞工程的中心內容是植物細胞和組織的離體培養；從技術上說，它是一種從單細胞到植株的無性繁殖技術；從遺傳的角度來講它具有雙重性，一是遺傳的保守性，二是遺傳的變異性。利用其保守性我們可以進行植物的快速繁殖，建立植物種質資源庫以及生成有用化合物；利用其變異性我們可以進行體細胞誘變、體細胞雜交以及基因工程。第2頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一植物脫毒與離體無性繁殖技術二花藥與花粉培養三植物胚胎培養第3頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一植物脫毒與離體無性繁殖技術意義植物脫毒離體無性繁殖第4頁,共151頁，2024年2月25日，星期天意義任何一個優良品種均需要有一個忠實地保存其遺傳性狀的繁殖方法。離體無性繁殖主要是以植物營養器官為外植體，繁殖過程在人工控制的環境條件下，所以既不會造成性狀分離同時還避免了病蟲害的侵染，從而可以很好地保持品種的優良特性，是異交作物和無性繁殖品種繁殖的一個非常理想的途徑。1、能夠有效地保持優良品種特性第5頁,共151頁，2024年2月25日，星期天離體繁殖周期短（1～3個月），不受季節限制，因此繁殖系數高（幾十至幾百倍），繁殖速度是任何其它方法所不能比擬的，所以通常將組織培養繁殖稱之為快繁（rapidclonalpropagation）。2、快速繁殖新品種繁殖系數（breedingcoefficient）：也叫增殖率，指每塊外植體在一個培養周期內增殖的倍數。第6頁,共151頁，2024年2月25日，星期天目前受病毒為害嚴重的作物有：①大田作物馬鈴薯、甘薯、甘蔗和煙草。②蔬菜白菜、大蒜、蔥、番茄和蘿卜。③果樹柑橘、蘋果、草莓和香蕉。④花卉香石竹、各種菊花、天竺葵和紫羅蘭等。3、生產無病毒種苗，防治品種退化第7頁,共151頁，2024年2月25日，星期天對于那些以塊根、塊莖、鱗莖為繁殖器官的作物來講，每年相當一部分產品要用作留種。如：①大蒜留種量占產量的1/5～1/8。②馬鈴薯留種量占產量的1/10。③貝母留種量占產量的1/3。

4、節約耕地，提高農產品商品產出率第8頁,共151頁，2024年2月25日，星期天常規營養繁殖器官多是塊根、塊莖、鱗莖、枝條等，體積大、含水量高，包裝、運輸十分不便，特別是遠距離調運損失很大。離體繁殖的種苗體積小，一般自帶容器，很容易攜帶，運輸方便。

-以馬鈴薯為例來講，按1畝地4000株計算，常規種薯4000個重約200kg,若用試管薯4000個則只有2kg。5、便于運輸第9頁,共151頁，2024年2月25日，星期天基本原理技術規程影響脫毒效果的因素植物莖尖脫毒第10頁,共151頁，2024年2月25日，星期天莖尖脫毒是控制植物病毒的有效途徑－藥物防治病毒效率低－抗病毒育種步履艱難－組織培養的高效隔離防止了病毒的再侵染脫毒－保持種性－快繁已是一個系統技術，在許多無性繁殖作物的種苗生產上均形成了自己的體系。1、基本原理第11頁,共151頁，2024年2月25日，星期天病毒在植物體內的分布具有不均勻性－1934年，White發現煙草花葉病毒（TMV）在煙草根中分布是不均勻的，越靠根尖區病毒含量越低，在根尖的頂端（生長點）不含病毒。－1949年，Limaset和Cornuet根據White的發現推測，病毒在煙草莖中的分布也可能存在與根部組織同樣的情況，莖尖分生組織也應不帶病毒。－1952年，Morel和Martin首先利用莖尖分生組織培養獲得了大麗花和馬鈴薯無病毒苗，同時建立了莖尖脫毒的組織培養技術體系。第12頁,共151頁，2024年2月25日，星期天能量競爭傳導抑制激素抑制酶缺乏抑制因子關于植物分生組織種不帶或很少帶有病毒的假說第13頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（1）被脫毒植物攜帶病毒的診斷（2）母體材料的選擇和預處理（3）莖尖分生組織培養再生植株（4）脫毒效果檢測（5）脫毒苗的保存與繁殖2、基本技術規程第14頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（1）被脫毒植物攜帶病毒的診斷基本規程在脫毒之前，首先應該了解植物攜帶何種病毒，其感染程度如何，以便采取適當處理措施。這種診斷一般根據病毒病的癥狀特征和表現程度進行判斷，必要時借助指示植物或血清學、分子生物學方法幫助鑒別。第15頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（2）母體材料的選擇和預處理基本規程母體的選擇：－欲脫毒材料的品種典型性－植株健康程度第16頁,共151頁，2024年2月25日，星期天外植體預處理：第17頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

香石竹在38℃～40℃條件下經兩個月處理可除去全部病毒。

菊花在35℃～38℃的條件下處理60天可使病毒失活。

馬鈴薯在37℃條件下處理10～20天能除去卷葉病毒。柑橘－速衰病毒/黃化病毒40℃/30℃條件下處理7～12周。鱗皮病毒需要在40℃/30℃條件下處理8周。啐葉病毒需要在50℃條件下處理3～22小時。洲青果病毒在50℃條件下處理30～40分鐘。第18頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（3）莖尖分生組織培養再生植株外植體消毒－莖尖剝離與接種－莖尖培養基本規程第19頁,共151頁，2024年2月25日，星期天－外植體消毒

在切取外植體之前莖芽進行表面消毒。葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、蒜和馬鈴薯等，則用0.1%次氯酸鈉或升汞表面消毒10分鐘。對于這些消毒方法，工作中應靈活運用，如在大蒜莖尖培養時，可將小鱗莖在75%酒精中浸蘸一下，再用燈火燒掉酒精然后解剖出無菌莖芽。

第20頁,共151頁，2024年2月25日，星期天ⅰ把莖芽置于解剖鏡下（8～40倍），一只手用鑷子將其按住另一只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常蘸入90%酒精，并用火焰灼燒以進行消毒。但應注意解剖針的冷卻，可蘸入無菌水進行冷卻；

ⅱ當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為提高成活率，可帶1-2枚幼葉然后將其接到培養基上；

ⅲ接種時確保微莖尖不與其他物體接觸，用解剖針接種即可。剝離莖尖時，應盡快接種，莖尖暴露時間應當越短越好，以防莖尖變干。可在一個襯有無菌濕濾紙的培養皿內進行操作，有助于防止莖尖變干。

－莖尖剝離與接種第21頁,共151頁，2024年2月25日，星期天shoottipshootapexapicalmeristemapicaldome第22頁,共151頁，2024年2月25日，星期天－莖尖培養將接種好的莖尖置于25℃左右的溫度下,每天以16h2000～3000lx的光照條件下培養。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠,所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數月才能培養成功。

第23頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共151頁，2024年2月25日，星期天指示植物鑒定(indicatortestplants)

所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專化性癥狀的寄主植物。血清鑒定(serologictest)

試管沉淀反應；免疫雙擴散；酶聯免疫吸附測定(ELISA)。

（4）脫毒效果檢測基本規程第25頁,共151頁，2024年2月25日，星期天指示植物鑒定(indicatortestplants)a.摩擦接種法：－取培養植株的葉片置于研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0），磨成勻獎；－將其涂抹在指示植株葉片上并在葉片上撒上金剛砂，通過輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細胞而又不損傷葉片；－5分鐘后清水清洗葉面。將指示植株放于防蚜蟲網罩的溫室內然后視其病斑的有無，來判斷是否脫除了病毒。如：植物液接種后如果使千日紅葉片枯斑，黃花煙、心葉煙呈花葉，證明該植物體內具有馬鈴薯X病毒。

第26頁,共151頁，2024年2月25日，星期天b.嫁接法

有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播的，例如草莓黃花病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進行傳播。這種病毒的鑒定需將培養植株的芽嫁接在敏感植物上，再根據敏感植株的病癥來判斷是否脫除了病毒。

第27頁,共151頁，2024年2月25日，星期天血清鑒定(serologictest)a.試管沉淀反應

在抗原-抗體最適比例的條件下，觀察有無沉淀的產生來確定被測植株是否帶病毒。試管沉淀反應操作簡單，需注意的問題：

①葉綠體的自發凝聚

可用磷酸緩沖液提取汁液，再用氯仿處理除去葉綠體，（pH保持在6.5～8.5）。

②抗原抗體的比例要適當，當抗原過量會抑制沉淀的形成。第28頁,共151頁，2024年2月25日，星期天絮狀沉淀反應：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內混勻，如抗原抗體對應，而又二者比例適當時，會出現肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應。環狀沉淀反應：是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知的抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿著管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應，在兩液界面出現白色的沉淀圓環。第29頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共151頁，2024年2月25日，星期天原理

絮狀沉淀試驗

抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質存在下，抗原與抗體結合出現可見的絮狀沉淀。(flocculationtest)方法評價：敏感度較低、簡便；易受抗原抗體比例影響臨床意義：可測定抗原抗體反應的最適比。第31頁,共151頁，2024年2月25日，星期天1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖

絮狀沉淀試驗絮狀沉示意圖淀AgAbAg第32頁,共151頁，2024年2月25日，星期天原理環狀沉淀試驗

把抗原液小心地加于已含抗體液的細試管液面上，當對應的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環。(ringprecipitationtest)方法評價：

敏感度較低、簡便；只能定性不能定量、缺乏多對分辨力。臨床意義：

鑒定血跡、診斷炭疽第33頁,共151頁，2024年2月25日，星期天AbAg環狀沉淀示意圖沉淀管內徑1.5～2mm1～5min出現沉淀環為陽性30min不出現沉淀環為陰性操作步驟第34頁,共151頁，2024年2月25日，星期天b.免疫雙擴散

在半固體凝膠中測定在其中擴散的抗原和抗體間的沉淀反應的方法。與沉淀法比較起來有兩個優點：一是節約血清，二是汁液不用特殊處理。

步驟：

①倒膠，一般厚2mm

②打孔，多打成梅花型

③加樣，加血清和汁液

一般加樣后在37℃恒溫過夜，即可進行結果觀察。有擴散沉淀的即為帶毒株，沒有則為不帶毒株。

第35頁,共151頁，2024年2月25日，星期天原理單向瓊脂擴散試驗

將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠中自由擴散，與相應抗體結合形成沉淀環，沉淀環大小與抗原濃度呈正相關。(singlegeldiffusiontest)方法評價：敏感度1.25mg/L、穩定、簡便、重復性和線性均好第36頁,共151頁，2024年2月25日，星期天瓊脂單擴散試驗示意圖第37頁,共151頁，2024年2月25日，星期天原理雙向瓊脂擴散試驗

將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成沉淀線。(doublegeldiffusiontest)應用：1.檢測未知Ag或Ab2.Ag性質分析3.Ab效價滴定4.Ag或Ab純度鑒定第38頁,共151頁，2024年2月25日，星期天瓊脂雙擴散試驗示意圖第39頁,共151頁，2024年2月25日，星期天瓊脂雙擴散試驗結果圖第40頁,共151頁，2024年2月25日，星期天Agargeldiffusiontest

左圖示抗體與樣本都起反應右圖示抗體只與一個樣本反應第41頁,共151頁，2024年2月25日，星期天c、酶聯免疫吸附測定

（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）

它是將抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合起來的一種綜合性技術。即通過化學的方法將酶與抗體或抗原結合起來，形成酶標記物。然后將它與相應的抗原或抗體起反應，形成酶標記的免疫復合物。結合在免疫復合物的酶，在遇到相應的底物時，催化無色底物生成有色底物，通過比色計可以準確測定。優點是靈敏度高，測定快速，每次可以同時測定多個樣品。

第42頁,共151頁，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心ELISA法示意圖第43頁,共151頁，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心ELISA捕獲試驗第44頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

采用電子顯微鏡，可直接觀察樣品材料有無病毒存在，還可進一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結構，這些特征相當穩定，因此電鏡檢查法既準確又有效，但需要有一定的設備和技術。

電鏡檢查法第45頁,共151頁，2024年2月25日，星期天分子檢測法

例如RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReation）將待測樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進行反應，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設計引物進行PCR反應，即可以知道在寄主中是否有病毒基因的表達。

第46頁,共151頁，2024年2月25日，星期天脫毒苗的離體保存與繁殖建立脫毒種苗生產繁殖網絡體系木本植物建立隔離的脫毒苗母本園（5）脫毒苗的保存與繁殖基本規程第47頁,共151頁，2024年2月25日，星期天母體材料病毒侵染的程度外植體的生理狀態起始培養的莖尖大小3、影響脫毒效果的因素第48頁,共151頁，2024年2月25日，星期天莖尖長(mm)葉原基數小植株數脫毒植株數脫毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響第49頁,共151頁，2024年2月25日，星期天離體無性繁殖是在人工控制的無菌條件下，使植物在人工培養基上繁殖的技術。跟常規繁殖方法相比，它是一種微型且快速的操作過程，因此，有時也稱之為微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapidcloneprogagation）。離體繁殖技術的應用，首先應歸功于Morel，他在1960年首先建立了蘭花離體繁殖的方法。目前已有近400種植物的離體繁殖獲得成功，其中許多有重要經濟價值的花卉（如蘭花、菊花、石竹等）、水果（如草莓、無籽西瓜、葡萄、香蕉等）、經濟作物（如馬鈴薯、甘蔗等）和林木（如桉樹、楊樹等）等，均已建立離體繁殖的種苗生產體系，取得了巨大的經濟效益和社會效益。離體無性繁殖(propagationinvitro)

第50頁,共151頁，2024年2月25日，星期天無菌培養物的建立培養物的增殖器官分化植株的形成和移栽第51頁,共151頁，2024年2月25日，星期天關鍵環節應用范圍需注意的問題第52頁,共151頁，2024年2月25日，星期天外植體的選擇－繁殖對象的品種典型性；－植物有自然條件下的繁殖特點。盡可能取自然繁殖器官的適當部位作外植體；－外植體的取材部位、大小和生理狀態關鍵環節第53頁,共151頁，2024年2月25日，星期天培養物的增殖－芽增殖－不定芽增殖－體細胞胚增殖－愈傷組織增殖關鍵環節第54頁,共151頁，2024年2月25日，星期天培養方法簡單，能高度保持遺傳穩定性，能長期繼代繁殖這一繁殖方式一般不需添加外源激素。如果某些植物需要使用激素，一定要嚴格控制濃度，以防止產生愈傷組織。腋芽增殖第55頁,共151頁，2024年2月25日，星期天從現存的芽以外的任何器官和組織上通過器官發生重新形成的芽稱為不定芽（adventitiousbuds）特點－繁殖系數高－遺傳穩定性較好－繼代次數有限不定芽增殖第56頁,共151頁，2024年2月25日，星期天胚狀體增殖增長率高，胚的雙極性免去了生根環節，但胚狀體休眠的誘導和解除還難以把握，其成苗率還不高。目前除一些特殊用途外（人工種子），這一技術途徑還沒有用于植物的快速繁殖。第57頁,共151頁，2024年2月25日，星期天所有的植物通過組織培養的方法均可以誘導形成愈傷組織，再進一步分化即可獲得小植株。這一途徑經歷了組織培養技術的所有過程，即從愈傷組織誘導、愈傷組織增殖、芽分化、根分化到形成完整植株。它屬于愈傷組織增殖

真正意義上的組織培養。一切通過其它增殖方式不能成功的植物，均可以通過愈傷組織的途徑獲得組培苗。愈傷組織增殖的特點是成功率高，繁殖系數大，但遺傳穩定性較差。對要求遺傳穩定性高的作物品種，一般不采用這一途徑快繁。第58頁,共151頁，2024年2月25日，星期天細胞或組織培養經原球莖途徑分化成植株。大部分的蘭花屬于這一類型，即蘭花的各個部分的離體組織都能誘導形成原球莖，再經培養分化形成植株。原球莖是蘭花種子萌發時產生的呈珠粒狀、縮短的、類似嫩莖的器官，是蘭科植物在誘導時分化出的原初植物形態，具有完整植株的器官雛形，成苗容易。原球莖增殖第59頁,共151頁，2024年2月25日，星期天關于試管苗生根與煉苗關鍵環節1.生根培養生根是獲得完整植株一個關鍵。通過腋芽、不定芽、愈傷組織途徑產生的芽長成試管苗，必須誘導生根才能移植。生根培養基一般要求降低礦物營養的濃度，

提高生長素的濃度，具體應根據植物不同而定。第60頁,共151頁，2024年2月25日，星期天2.生產用苗的培育

－試管苗的生長環境：無菌異養高溫弱光恒溫

第61頁,共151頁，2024年2月25日，星期天a、壯苗

加入生長控制劑，如多效唑，B9（丁酰肼），CCC（矮壯素），其作用是使苗粗壯，葉綠素增加。

b、煉苗：將瓶蓋打開打破無菌環境，濕度逐漸下降，光照逐漸加強，使之形成新的功能強的根和葉片。一般煉苗時間為10～30d。－移栽前的工作第62頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

－移栽時應注意的問題

a、防止菌類滋生

b、保持小苗水分供給

c、移栽時選擇合理的種植基質

d、注意一定光照，溫度條件第63頁,共151頁，2024年2月25日，星期天自然無性繁殖極易感染病毒的植物，如馬鈴薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等。有性繁殖變異范圍過大而自然條件下又不易無性繁殖的植物如非洲菊、花竹和紫羅蘭等。某些難以繁殖或繁殖系數很低的植物，某些需要加速繁殖的特殊基因型如名貴花卉、優良資源、果樹芽變體和轉基因植物等。應用范圍第64頁,共151頁，2024年2月25日，星期天增殖方式的合理選擇外源生長調節劑對品種典型性的影響繼代次數與變異需注意的問題第65頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二花藥與花粉培養概念及意義花藥培養花粉及小孢子培養單倍體植株的鑒定及二倍化第66頁,共151頁，2024年2月25日，星期天花瓣雄蕊萼片雌蕊花托花柄第67頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第69頁,共151頁，2024年2月25日，星期天花藥培養（antherculture）屬于器官培養范疇。花粉培養（pollenculture）也稱為小孢子培養（microsporeculture）,屬于細胞培養類型。

概念及意義第70頁,共151頁，2024年2月25日，星期天花藥培養與小孢子培養目的一樣，為了獲得單倍體－一定條件下，花藥培養與小孢子培養可以得到再生植株。這樣的植株只含有一套染色體，數目和配子體相同，因而是單倍體植株。－單倍體植株經過染色體加倍就成為加倍單倍體植株（doubledhaploidplants,DH植株）或稱純合二倍體。第71頁,共151頁，2024年2月25日，星期天hexaploid植物其haploid為triploid

普通小麥2n＝6x＝42n＝3x＝21octoploid植物其haploid為tetraploid

草莓2n＝8x＝56n＝4x＝28第72頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

單倍體植物與其二倍體相比較，有三個明顯特點：－體細胞染色體數減半－生長發育弱，體形小，各種器官明顯減小－雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代第73頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

純合二倍體不僅育性可以恢復且在遺傳上是純合的。加倍單倍體育種（DH育種）技術在植物遺傳育種上的價值體現在：－加快常規育種速度－提高常規育種選擇效率第74頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

常規育種，雜種F2代開始分離，繼續自交，通過不斷選擇和淘汰，一般需到F5～F6代才能得到純合后代。花藥、花粉培養可得到單倍體植株，染色體加倍后即獲得純合二倍體。從雜交到獲得純合株系，只需二個世代。因此，可以縮短育種年限3～4個世代。第75頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

在常規雜交后代中，存在顯、隱性的干擾從而影響選擇的準確性和效果，在加倍單倍體的后代中只有一種基因型和表現型，不存在顯性性狀掩蓋隱性性狀的問題，不良性狀在當代即可表現出來，便于淘汰。因此，利用花藥培養的單倍體育種技術可提高選擇效率。第76頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

小麥高稈（D）對矮稈（d）為顯性，抗銹病（T）對不抗銹病（t）為顯性，現在有純合的高稈抗銹病的小麥（DDTT）和矮稈不抗銹病的小麥（ddtt），問怎樣才能得到矮稈抗病的優良品種（ddTT）？第77頁,共151頁，2024年2月25日，星期天Ｐ高抗矮不抗F1

高抗F2DDTTddttDdTtddTt高抗高不抗矮抗矮不抗ddTT矮抗ddTTddTt矮抗ddTT矮抗矮抗矮不抗ddTtddTT雜交自交選優自交F3選優第78頁,共151頁，2024年2月25日，星期天選育純種選用純合親本雜交利用現有基因重新組合選種

連續自交第79頁,共151頁，2024年2月25日，星期天Ｐ高抗矮不抗Ｆ１高抗DDTTddttDdTtdtdT雜交F1植株花粉單倍體幼苗DTDt花藥離體培養dtdTDTDt秋水仙素處理ddttddTTDDTTDDtt正常植株（純合子）矮抗第一年第二年矮桿抗病新品種第三年第80頁,共151頁，2024年2月25日，星期天單倍體途徑的應用潛力：－迅速獲得純合型材料，縮短育種年限，提高選擇效率－獲得育種中間材料－與誘變育種相結合可以提高誘變頻率－與細胞融合相結合，使這一育種途徑更具有實際應用意義－作為遺傳工程受體更為有效－用作基礎遺傳研究的各個領域第81頁,共151頁，2024年2月25日，星期天flowerbud花芽anther花藥antherculture花藥培養haploidcallus單倍體愈傷組織haploidembryo單倍體胚haploidplantlets單倍體植株colchicinetreatment秋水仙素處理homozygous純合的,同型結合的heterozygous雜合的，雜合子的diploid二倍體donorplant供體植株，母體植株第82頁,共151頁，2024年2月25日，星期天首先報道通過花藥培養獲得單倍體植株成功的是印度學者Guha和Maheshwari(1964,1966)。目前已有250多種高等植物花藥培養成功。我國花藥培養獲得單倍體的技術途徑在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應用。

我國通過花藥培養途徑培育出大面積推廣應用的水稻品種“寒花早”、“中花8號”等，小麥品種“京花1號”。同時還獲得大批具有育種價值的單倍體系。花藥培養第83頁,共151頁，2024年2月25日，星期天概念花藥培養（antherculture）指把發育到一定階段的花藥接種在人工培養基上，使其發育和分化成為植株的過程。第84頁,共151頁，2024年2月25日，星期天基本環節外植體選擇－外植體(花蕾)預處理－外植體消毒－花藥分離與接種－誘導培養－分化培養-移栽第85頁,共151頁，2024年2月25日，星期天供試材料的遺傳背景－目前，通過花藥培養成功獲得單倍體植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科和百合科等。－不同植物類型和同一類型的不同品種對花藥培養的反應也是不同的。技術要點外植體選擇第86頁,共151頁，2024年2月25日，星期天供試材料的生理狀態

在多年生植物中，幼年植株比老齡植株的花藥誘導頻率高。草本植物生長健壯且處于生殖生長高峰期的花藥誘導頻率較高，而徒長或是營養不足的植株花藥培養的誘導頻率較低。第87頁,共151頁，2024年2月25日，星期天花粉發育時期四分體—小孢子—單核花粉—雙核花粉最適期－Sunderland(1971)對煙草不同花粉發育時期的培養反應進行了觀察：花粉發育時期胚狀體誘導頻率(％)

減數分裂期0

單核早期14

單核晚期40

雙核早期55第88頁,共151頁，2024年2月25日，星期天外植體預處理大量試驗結果表明，花藥培養前給予一定的低溫處理是十分必要的。－煙草、茄子3～5℃下72小時－水稻10℃下10～14天－柑橘3℃下5～10天－馬鈴薯4℃下48小時技術要點第89頁,共151頁，2024年2月25日，星期天低溫處理的作用：－低溫能使花粉保持較長的生活力，延緩花藥壁組織的衰老和降低花粉的死亡率，從而增加有效存活的花粉數量，使較多的小孢子完成從配子體到孢子體發育類型的轉變。第90頁,共151頁，2024年2月25日，星期天挑出適宜培養的花蕾或幼穗，一般先將花蕾或幼穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中浸泡3～5min，無菌水沖洗3～5次。若花蕾包裹嚴密內部一般是無菌的，只需要用蘸有70%酒精的棉球對葉鞘或花蕾進行表面擦拭就可達到滅菌的目的。

外植體的表面消毒技術要點第91頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

將消毒過的材料置于超凈工作臺上，無菌剝取花藥進行接種。在剝取花藥時，應注意在整個操作過程中盡可能避免花藥受到損傷，否則常常會刺激花藥壁形成愈傷組織。若是花藥較大的材料，可用解剖刀或鑷子剝開花蕾，取出花藥。如果是花器很小，可能需借助解剖鏡夾取花藥，或只是把花被去掉，將其余部分接種在培養基上。接種時盡量減少花藥在空氣中的暴露時間，將花藥水平地放在培養基上進行培養。接種密度因培養方式而異。

花藥分離與接種技術要點第92頁,共151頁，2024年2月25日，星期天花藥培養培養基－花藥培養常用的基本培養基：

MS（Murashigc&Skoog，1962）

Nitsch(Nitsch，1969)N6(朱至清，1974)B5(Gamborgetal，1976)－附加成分：蔗糖,激素。技術要點第93頁,共151頁，2024年2月25日，星期天蔗糖在花藥誘導培養階段的主要功能是:提供C源；維持適宜的滲透壓；抑制花藥壁分裂而促進花粉細胞的分裂番茄花藥培養愈傷組織誘導頻率對蔗糖濃度的反應

蔗糖濃度2％3％4％6％10％13％17％

誘導頻率5％10％12％18％25％45％8％第94頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

在花藥的誘導培養期間（脫分化），需要有較適宜的細胞分裂素和生長素配比，從而有效地誘導花粉細胞啟動分裂，同時控制二倍體細胞的分裂。常用的激素：

-細胞分裂素類：BA、KT、玉米素

-生長素類:NAA、IAA、2,4-D

第95頁,共151頁，2024年2月25日，星期天高秀云等對茄子的研究表明：MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT1mgl-1n93.8%2n6.2%MS＋2,4-D2mgl-1＋KT1mgl-1n64,1%2n35.9%高濃度的2,4-D主要誘導花藥形成愈傷組織，而不能形成胚狀體，從而增加了二倍體細胞發育的機會。第96頁,共151頁，2024年2月25日，星期天培養條件－溫度和光照

溫度：25～28℃下進行花藥和花粉培養。－柑橘在20℃以下完全不能形成胚狀體，愈傷組織形成亦很少；溫度提高到21～25℃時便有胚狀體形成，而當溫度提高到26℃以上時又完全不能夠形成胚狀體。－油菜若將接種后的花藥在30℃條件下培養2～3天，可顯著提高花粉胚的形成率。－小麥在33℃條件下培養3～5天可提高成愈率和綠苗率第97頁,共151頁，2024年2月25日，星期天光照：先弱后強，光照1000～2000lx、光周期14h條件下進行分化培養；關于光質對花藥和花粉培養影響的研究較少。第98頁,共151頁，2024年2月25日，星期天培養方法

－固體培養－液體培養－雙層培養－分步培養－條件培養第99頁,共151頁，2024年2月25日，星期天固體培養Antherandhaploid

plantletsonasolid

mediumcontaining

activatedcharcoal第100頁,共151頁，2024年2月25日，星期天Antherandhaploid

plantletsonaliquid

mediumcontaining

activatedcharcoal液體培養第101頁,共151頁，2024年2月25日，星期天在3.5cm小培養皿中鋪加一層（1ml）瓊脂培養基，待固化后，在其表面再加入0.5ml液體培養基。優點在于花藥在培養早期可以從活性高的液體培養基中汲取營養，花粉胚長大后又不會沉沒，可以在通氣良好的條件下分化成植株。雙層培養第102頁,共151頁，2024年2月25日，星期天將花藥接種在液體培養基上進行漂浮培養，花粉可以從花藥中自然釋放并散落在液體培養中，然后及時用吸管將花粉從液體培養基中取出，植板于瓊脂培養基上，使其處于良好的通氣環境，使得花粉植株的誘導率大大提高。分步培養第103頁,共151頁，2024年2月25日，星期天用預先培養過花藥的液體培養基再次進行花藥培養，可使花藥培養效率大大提高。條件培養基不存在種的特異性，例如培養過小麥花藥的培養基對大麥同樣有效果。

條件培養基培養第104頁,共151頁，2024年2月25日，星期天Sunderland(1978)明確提出藥壁因子作用假設，認為當花粉對花藥壁因子接受能力最大的時期與花藥壁因子作用的最大時期一致時，植株的花藥最易被誘導。-組織學研究也證實藥壁因子在誘導花粉胚中起著關鍵作用。在煙草中，只有原來貼靠著花藥壁的花粉粒才能順利發育成花粉胚。在天仙子中，也只有處在藥室外圍緊靠絨氈層的花粉能夠發育成花粉胚。關于藥壁因子第105頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第106頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

離體培養的花藥中小孢子改變發育途徑，經過連續多次細胞分裂發育為孢子體的過程，通常稱為雄核發育（androgenesis)：花藥培養中單倍體形成的途徑第107頁,共151頁，2024年2月25日，星期天培養初期花粉發育的途徑根據Sunderland、Wicks和Norreel的研究，可以把早期花粉發育分為三類：(1)單核正常非均等分裂形成一個生殖核和一個營養核以后，或一個生殖核發育，或一個營養核發育，或二者均等發育。(2)單核均等分裂為兩個子細胞，以后不斷發育。(3)異常多核花粉粒發育有些小孢子核連續分裂3次，形成類似8核胚囊的現象，稱為花粉胚囊。第108頁,共151頁，2024年2月25日，星期天單倍體植株形成途徑－通過胚狀體形成單倍體植株－通過愈傷組織形成單倍體植株

第109頁,共151頁，2024年2月25日，星期天-通過早期的分裂，單個花粉粒細胞形成了一個多細胞團，這種多細胞團從花藥壁中釋放出來后按照合子胚的途徑發育，經過球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚的發育過程。

-由胚狀體的發育過程可以看出，一個花粉粒只形成一個胚狀體，一個胚狀體萌發出一個植株。也就是說，通過胚狀體形成的植株均是來自單個花粉粒。通過胚狀體形成單倍體植株第110頁,共151頁，2024年2月25日，星期天-花粉粒早期分裂的細胞團如果一直保持無序分裂狀態，會形成多細胞團的愈傷組織，進一步分化成植株。目前為止，大多數花藥培養成功的植物都是由這一途徑產生。

-通過愈傷組織形成的植株其倍性常不只是單倍體也有二倍體，有時還有多倍體、混倍體等。通過愈傷組織形成單倍體植株第111頁,共151頁，2024年2月25日，星期天NAA濃度對甜椒品種“二豬咀”花藥誘導胚狀體的影響NAA(mgl-1)0.251.02.0embryoid(%)6.451.91.11callus6.79.212.9第112頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

植株再生途徑與倍性

植株來源

倍性

細胞類型embryoidn單個花粉粒callusn/2n/2n+單個或多個花粉粒花粉細胞與花藥壁細胞等第113頁,共151頁，2024年2月25日，星期天①誘導頻率低。頻率最高的煙草也只有30%，低的只有百分之幾，千分之幾；

②體細胞（花絲、藥壁、藥隔）干擾問題；

③藥壁絨氈層細胞對花粉發育的作用以及如何用合成培養基代替氈絨層的作用還不十分清楚，目前培養基成分帶有一定的盲目性；

④白化苗問題

存在的問題第114頁,共151頁，2024年2月25日，星期天禾谷類植物的花藥培養中經常會出現白化苗－愈傷組織分化綠苗或白苗的特性是相對穩定的，綠苗和白苗混生的現象只占極少數。－影響花粉白苗形成的因素可能包括：供體植物的基因型、花粉發育時期、培養基成分和培養條件等。－染色體結構的變異可能是白化苗的成因。第115頁,共151頁，2024年2月25日，星期天概念花粉培養（pollenculture）即小孢子培養（microsporeculture）,是從花藥中分離出花粉粒使之成為分散的或游離的狀態，通過培養使花粉粒脫分化進而發育成完整植株的過程。花粉及小孢子培養第116頁,共151頁，2024年2月25日，星期天關鍵環節

取材時期的確定－花粉的分離－花粉的培養第117頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－小孢子花粉粒－－－－－－－－－－－－花粉培養花藥培養技術要點取材時期的確定第118頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

－機械分離法－花藥漂浮自然釋放法

技術要點

花粉或小孢子的分離第119頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

培養方法技術要點－哺育培養－看護培養－微室培養

第120頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第121頁,共151頁，2024年2月25日，星期天a、花藥培養容易受藥壁、藥隔、花絲等體細胞組織的影響，再生植株會出現不同倍性的個體，而花粉培養可以克服這一不足。

b、能更好調節控制核發育的各種因子，而且可直接從單細胞開始觀察整個雄核發育的過程，為研究雄核生理生化等問題提供方便。

c、原則上講，從花粉培養能得到更多的花粉植株。

花粉培養的優點第122頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

與其他器官的培養技術相比，花粉粒培養還不成熟，影響培養的效果可能很多，要非常系統歸納還不可能，簡述如下：

A在培養前分離的花藥應多次洗滌，否則其生長和形態發生將受影響，不洗滌的花粉不能生長或只能形成愈傷組織

B冷處理已廣泛用來提高花粉雄核發育的頻率

C培養基中增加蔗糖和肌醇的濃度能明顯提高雄核發育的頻率。

第123頁,共151頁，2024年2月25日，星期天單倍體植株的鑒定及二倍化

－形態學鑒定－染色體分析鑒定方法第124頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

－秋水仙素處理加倍－繼代加倍－創傷法加倍

單倍體植株的二倍化第125頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三植物胚胎培養根據培養中所取外植體部位及取材時期不同，植物胚胎培養包括：胚培養、胚乳培養、胚珠培養以及子房培養。胚珠和子房培養由于取材時期不同，包括受精以后的胚珠子房培養、未受精胚珠和子房培養。第126頁,共151頁，2024年2月25日，星期天胚培養胚乳培養第127頁,共151頁，2024年2月25日，星期天植物胚培養(embryocultureofplants)胚培養在實踐中的意義－克服雜交育種中雜種胚的早期夭折－克服珠心胚干擾，提高育種效率－理論研究領域的應用1.胚培養的意義和類型第128頁,共151頁，2024年2月25日，星期天胚培養的類型－成熟胚(matureembryo)培養－幼胚(immatureembryo)培養第129頁,共151頁，2024年2月25日，星期天成熟胚培養－成熟胚一般指子葉期后至發育完全的胚。培養較易成功，在含有大量元素和糖的培養基上能正常生長成幼苗。由于種子外部有較厚種皮包裹不易造成損傷，易于進行消毒，因此，將成熟或未成熟種子用70%酒精進行幾秒種的表面消毒，再用無菌水沖洗3～4次，然后在無菌條件下進行解剖，取出胚并接種在適當的培養基上培養。

第130頁,共151頁，2024年2月25日，星期天幼胚培養－幼胚是指子葉期以前的幼小胚，由于幼胚培養在遠緣雜交育種上有極大的利用價值，因此，其研究和應用越來越深入和廣泛。隨著組織培養技術不斷完善，幼胚培養技術也在進步，現在可使心形期胚或是更早期的長度僅0.1～0.2mm的胚生長發育成植株。

第131頁,共151頁，2024年2月25日，星期天Hanning早在1904年就培養了蘿卜和辣根菜的胚，發現離體胚可以充分發育，并且提前萌發形成小苗，這是世界上胚培養最早獲得成功的一例。Laibach在1925～1929年間，培養亞麻種間雜種幼胚，成功地獲得了種間雜種，首次證實了這種方法在實際應用中的價值。李繼侗，1933年在銀杏培養中發現了胚乳提取物能夠促進銀杏離體胚的生長。為后人使用植物胚乳汁液、幼嫩種子及果實提取液等天然物質促進培養物的生長具有啟示作用。2.幼胚培養

第132頁,共151頁，2024年2月25日，星期天－取材時期－幼胚剝離－培養條件與控制幼胚培養的關鍵技術第133頁,共151頁，2024年2月25日，星期天A)GlobularB)heartshapedC)torpedo

大多數幼胚培養成功的實例證明，適宜于幼胚培養的胚發育時期多為球形胚至魚雷形胚。以幼胚搶救為目的的胚培養取材，必須在胚退化衰敗之前。

取材時期第134頁,共151頁，2024年2月25日，星期天－幼胚是一種半透明、高粘稠狀組織，剝離過程中極易失水干縮，一定要注意保濕，且操作要迅速。－有關胚發育的細胞學和生理生化研究表明，胚柄積極參與幼胚發育，特別球形胚期以前的幼胚培養，剝離時應帶胚柄。幼胚剝離第135頁,共151頁，2024年2月25日，星期天剝離出來的幼胚要立即接種到培養基上進行培養。在培養之前必須對所培養的對象在自然發育條件下的特性充分了解，如胚的休眠問題、是否需要春化作用以及胚萌發的溫度等。培養條件的控制（是否需要特殊處理）第136頁,共151頁，2024年2月25日，星期天－胚性發育－早熟萌發－愈傷組織幼胚離體培養的生長發育方式第137頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

幼胚接種到培養基上以后，仍然按照在活體內發育方式發育，最后形成成熟胚(有時甚至可能類似種子)，然后再按種子萌發途徑出苗形成完整植株，這種途徑發育的幼胚一般一個幼胚將成為一個植株。

胚性發育(embryonaldevelopment)第138頁,共151頁，2024年